倪瑾瑶，陈晓湖，缪成锋，徐菲菲，陈国荣，蔡国平

(温州医科大学附属第一医院病理科，浙江 温州 325000)

肺癌是当今世界最常见的恶性肿瘤,每年新发病例约182万[1]。在男性和女性中，发病率分别居于前列腺癌和乳腺癌之后,位列各类肿瘤第二位，而死亡率则排第一[2]。肺癌中，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占绝大多数，约为85%[3]。肺腺癌约占NSCLC的一半，且发病率呈上升趋势[4]。肺腺癌的传统治疗方法有手术治疗和化疗等。近年来，靶向治疗在临床上取得不错的疗效而受到广泛关注。靶向治疗是指在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌位点来设计相应的治疗药物，药物进入体内特异性地杀伤癌细胞[5]。目前，已知约有20多种靶向治疗的靶点，即发生突变的癌基因或者抑癌基因，比如表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)[6]、间变性淋巴瘤激酶(anaplasticlymphoma kinase,ALK)[7]和鼠类肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene,Kras)[8]等。

ALK基因是一个重要靶点，独立于EGFR和KRAS等基因[9]。ALK属于胰岛素受体家族成员，由1620个氨基酸组成，包括细胞外配体结合区、跨膜区和胞内区。棘皮动物微管相关蛋白样4(echinoderm microtubule-ass℃iated protein like 4,EML4)，主要有3部分，包括N末端碱基区、棘皮动物微管相关蛋白区以及WD重复区。EML4-ALK是ALK基因重排最常见的一种形式,是由于2号染色体短臂发生倒位所致，N-末端的EML4与胞内ALK激酶相融合，促进了嵌合酪氨酸激酶的表达。小分子药物克唑替尼为ALK基因靶向药物，能够特异性靶向抑制ALK基因，也能够抑制c-MET基因，已被批准用于ALK基因阳性的肺癌患者的治疗。针对ALK基因抑制剂的应用，ALK基因重排的检出具有重大意义，如何选择一种简便、迅速、经济的方法成为困扰临床的问题。

目前，ALK基因重排检测常用的方法有荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)、逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)、免疫组化(immunohistochemistry，IHC)等[10]。FISH是国际上公认的标准，该技术相对快速、标准化，但比较昂贵，并且专业化要求较高。相对来说，IHC是一种快速、相对经济的方法，而在IHC基础上发展起来的Ventana IHC相对来说更方便、快捷。Ventana IHC的实验成本较低，目前国内收费大约是FISH的1/4,而且，Ventana IHC操作简便，染色时间短(约4 h)，判断标准统一。本实验以肺腺癌患者为研究对象，分别采用FISH和Ventana IHC检测ALK基因的表达，比较两者检出率，旨在探讨Ventana IHC是否能成为首选初筛手段，降低患者的经济负担。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集2013年1月至2015年6月温州医科大学附属第一医院病理科诊断的肺腺癌病例，随机选取手术切除标本，总共200例(年龄38～80岁，平均63.33岁)，在手术治疗前均未经化疗。将选择的石蜡组织制备成组织芯片。通过病案系统查询患者的临床信息，包括年龄、性别、吸烟史等，同时查阅病理取材记录及病理报告，记录肿瘤大小以及淋巴结转移情况。肺腺癌的分期根据TNM分期。肺腺癌的病理分级根据2015年WHO和2011年IASLC/ATS/ERS肺癌分类。

1.2 主要试剂

ALK基因重组检测试剂盒(Abbott公司，美国)、Ventana ALK IHC试剂盒(Roche Diagnostics Gmbh，德国)

1.3 Ventana IHC

组织芯片切片(4 μm厚)，并将其装载于带正电的玻璃载玻片上，烤片后，配合Ventana ALK IHC试剂盒，使用罗氏公司Benchmark XT全自动免疫组化染色仪进行染色，染色方法参照厂家试剂盒说明书。检测结果由两名资深病理医生独立观察和评定，判断标准按照说明书采取二元法判读：异常ALK蛋白表达位置在细胞浆，肿瘤胞浆表现出很强的颗粒状胞浆信号(任何百分比)，即ALK阳性；肿瘤细胞胞浆无染色，则为ALK阴性。

1.4 荧光原位免疫杂交(FISH)

组织芯片切片(4 μm厚)，60℃烤片2 h，二甲苯脱蜡、酒精脱水，空气干燥。预处理液硫氰酸钠80℃处理(12±3)min，室温纯水3 min，擦干切片，预温酶溶液至37℃，预温1 h后使用，浸没组织切片(20±2)min，室温纯水3 min，经70%、85%、100%乙醇脱水各1 min，吸水纸擦干，空气干燥，在样本区域加入10 μl，添加盖玻片，以封片胶固定，在原位杂交仪(STATSPIN公司)中经过73℃变性3 min，37℃杂交18 h，杂交后于洗液Ⅰ和洗液Ⅱ中洗脱，风干后加入10 μl DAPI，盖好盖玻片。由两名病理医师在荧光显微镜油镜下用橙绿双通滤光片独立观察。在正常细胞核中，ALK双色分离探针杂交后，会产生1个橙色、绿色融合信号或者相邻的橙绿信号，为细胞阴性；当细胞核中存在ALK基因断裂异位时，会表现为一组橙色和绿色荧光信号分离的距离超出两个信号半径大小，或者表现为单独存在的一个橙色荧光信号且不伴有相应的绿色荧光信号，为细胞阳性。标本FISH判断标准：至少观察50个肿瘤细胞，阳性细胞数目<10%为阴性，>50%为阳性，10%～50%换人重新计算，前后阳性细胞相加算百分比，<15%为阴性，≥15%阳性。

1.5 统计学处理

采用SPSS 20.0软件对结果进行统计处理。存在ALK融合基因的病例与临床病理因素的关系，采用t检验和Fisher确切概率法。

2 结果

200例肺腺癌病例中，Ventana IHC检测发现5.5%(11/200)的患者发生ALK基因重排(图1),FISH检测发现4.5%(9/200)的患者发生ALK基因重排(图2)。其中，2例患者表现为FISH(-)、Ventana IHC(+)，1例经外院基因检测，为EGFR阳性，服用凯美钠，效果良好，另1例未做过基因检测，我们进一步予RT-PCR检验，结果为ALK阴性，因此最终判定这两例病例未发生ALK基因重排。根据最终的FISH检测结果，ALK阳性总计9例，阳性率为4.5%(9/200)，则Ventana IHC的敏感性和特异性分别为100%和98.95%，FISH 和Ventana IHC之间的一致性为99%。

200例病例中，ALK 阳性病例与ALK 阴性病例相比，在年龄、性别、肿瘤大小、吸烟史、病理分期等方面，均无明显统计学差异。9个ALK阳性病人中，以腺泡为主型腺癌5例，伴粘液的实体为主型腺癌2例，乳头状为主型腺癌1例，浸润性粘液腺癌1例。其中有6例病例伴有印戒细胞，3例病例不伴有印戒细胞(图3)。

3 讨论

肺癌分为小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和NSCLC，NSCLC占绝大多数，约为85%[3]。肺腺癌约占NSCLC的一半，且发病率呈上升趋势[4]。近年来，EGFR等驱动基因突变为靶点的新型酪氨酸激酶抑制剂在肺腺癌的治疗中取得了重大突破，为患者带来新的曙光。继EGFR后，研究者又发现另一靶点：EML4-ALK[9]。虽然ALK基因突变率非常低，大约是3%～6.7%，远远低于肺癌中EGFR突变率，但是，ALK抑制剂(克唑替尼)在ALK基因突变的患者中取得良好的疗效[11]。第50届美国ASCO年会中研究人员报告，在ALK基因突变的肺腺癌治疗中，克唑替尼对比含铂化疗药的疗效显示：接受克唑替尼或者含铂化疗药物治疗的343例ALK基因突变患者中，克唑替尼治疗组和含铂化疗药物治疗组对比结果为ORR 74%vs49%，PFS 10.9vs7.0，验证了克唑替尼靶向治疗的有效性。在临床中，肺癌晚期病人使用克唑替尼之前，大多需要FISH技术检测ALK基因是否突变。然而，FISH技术要求高、价格昂贵以及耗时。相反地，Ventana IHC 染色时间短，镜下组织结构清晰，对比明显，二元判读，敏感性高，检测花费低，实用性更强。

本实验结果显示，Ventana IHC共有11例阳性，而FISH 有9例，有两例结果不一致。1例病例查阅资料发现患者已经做过基因检测，为ALK阴性，EGFR阳性，目前服用凯美钠，效果良好。另1例未做过检测，遂我们进一步做了RT-PCR，结果显示为ALK阴性，因此最后确认ALK阳性有9例。ALK基因突变率非常低，为3%～6.7%[9]，本实验中ALK阳性率为4.5%，也是比较接近的。

本次研究中，以FISH检测结果作为对比，Ventana IHC相对于FISH 的敏感性和特异性分别是100%和98.95%，总体一致性为99%，这与许多人的研究结果相同。Paik J.H等通过对640个病例分析，采用5A4抗体对肺癌患者进行Ventana IHC检测，同FISH相比，Ventana IHC的敏感性和特异性分别是100%和98%，其中，有10例表现为FISH阴性而Ventana IHC阳性[12]。Mahe E分别用ALK1抗体、5A4抗体、D5F3抗体对594例肺癌手术标本进行免疫组化检测，同时予以FISH检测，结果显示FISH 阳性有7例，而ALK1、5A4、D5F3阳性分别有13、18、13例，与FISH相比较，这三种抗体的敏感性均为100%，特异性分别是99%、98%、99%[13]。Harold C等对110例非小细胞肺癌病例分别进行FISH和IHC检测，其中FISH阳性有7例，而IHC则有11例，有4例结果与FISH不符，遂进一步采用RT-PCR，其中1例结果为阳性，另外3例仍为阴性，IHC的敏感性和特异性分别是100%和96%[14]。上述研究都表明，Ventana IHC敏感性非常高，阴性预测价值大。

通过查阅入组病人的临床资料发现，在11例Ventanna IHC检测阳性的病人中，有5例是做过基因检测的，其中有4例FISH阳性的病例EGFR均为阴性，发现ALK突变与EGFR突变不同时存在，与文献所报道的一致[15]。其中有1例病例EGFR基因检测为阳性，ALK为阴性，此次实验中，ALK免疫组化为阳性、FISH为阴性，该结果可能是EGFR突变引起这两种酶蛋白的互相作用最终导致ALK蛋白的表达，在肺癌细胞系中ALK与EGFR的同时激活已经有相关介绍[16]。

研究表明，EML4-ALK阳性多见于年轻、不吸烟或者吸烟较少的肺腺癌患者[17]。本次研究中，我们通过比较得出，ALK突变与临床及病理特征无关，这可能与我们有限的标本数量有关。但是根据本研究中阳性病例的构成比来看，有7例病例的年龄小于总体病例的平均年龄，2例病例的年龄大于总体病例的平均年龄，说明ALK阳性可能多见于年轻患者。9例病例中，5例为腺泡为主型，2例为伴有黏液的实性为主型，1例为乳头状为主型，1例为浸润性黏液腺癌，并且，其中6例可看到印戒细胞，3例未见，说明ALK阳性与印戒细胞有关联。Shaw在分析141例肺癌后得到19例ALK阳性病例，其中有18例为腺癌，并且大多数病例可见印戒细胞。而这在ALK阴性中非常少见[18]。由此猜想，ALK阳性与印戒细胞有关，具体待进一步研究。

经本次研究，我们发现Ventana IHC检测EML4-ALK的的敏感性和特异性很高，与FISH高度一致。该技术成本较低，技术要求不高，检验流程标准化，是一种能进行大规模ALK基因筛查的方法。在临床上，Ventana IHC可以作为一个高效、便捷、经济的初筛工具，为减轻病人及全社会经济负担的可行性提供了数据上的支持。