郭洁儿，邓洁莹，骆雨雨，张淑晶，李 云

（韩山师范学院食品工程与生物科技学院，广东潮州 521041）

γ-氨基丁酸 （γ-aminobutyric acid，GABA） 是一种经谷氨酸脱羧酶 （Glutamatedecarboxylase，GAD） 催化L-谷氨酸 （L-glutamic acid） 脱羧生成的天然非蛋白质氨基酸[1]。作为一种重要的抑制性神经递质，GABA在中枢神经系统中发挥作用。越来越多的研究表明，GABA具有很多对人类健康有益的生理功能，包括抗高血压、镇静、抗糖尿病、抗肥胖和抗癌等[2]。

制备GABA的方法主要有化学合成法和生物合成法两大类。化学合成法不适合制备作为食品功能添加剂的GABA，因为化学合成过程中使用的有毒化学品可能残留在最终产品中[3]。生物合成法是利用具有GAD活性的微生物合成GABA，与化学合成法相比，生物合成方法更容易实施，有更好的安全性，并且能在高选择性和更少的副产物条件下获得产生理想的产量。生物合成法包括微生物细胞生物转化法和微生物发酵法2种。利用微生物（特别是GAD活性高的乳酸菌）的细胞生物转化是大规模GABA生产的一种很有前途的技术，具有反应时间短、工艺简单、后续分离纯化容易等优势，近年来受到了广泛的关注。微生物细胞转化法，先通过培养细胞，得到细胞悬液后离心去掉培养基，再制备菌悬液与底物等反应，简化了反应体系，有利于下游GABA的分离纯化。目前，利用乳酸菌生物转化制备GABA已有报道，采用的菌种有戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）[4]、短乳杆菌 （Lactobacillus brevis）[5]和嗜酸乳杆菌（L.acidophilus）[6]等。植物乳杆菌（L.plantarum） 是一种食品级安全的乳酸菌菌株，利用植物乳杆菌制备GABA，是比较安全、理想的途径。试验以从发酵食品中分离的1株高GAD活性的植物乳杆菌P48作为菌种，研究了P48细胞生物转化法制备GABA的特性。通过在不同pH值、温度、底物浓度和产物浓度的条件下进行反应，探究反应的最佳条件，使得转化液中的GABA中产量达到最高，将为植物乳杆菌P48在大规模转化制备GABA提供有效的试验参考数据。

1 材料与方法

1.1 试剂

γ-氨基丁酸（纯度99.5%）、谷氨酸—钠盐（L-MSG纯度为99.5%），配制培养基用胰蛋白胨、牛肉膏、酵母粉为生化试剂，其他均为分析纯试剂。

1.2 菌种和培养基

1.2.1 菌种

分离于自然发酵酸菜，由发酵实验室保藏。

1.2.2 培养基

改良PSB培养基：胰蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉2.5 g，葡萄糖20 g，乙酸钠0.83 g，吐温1 g，L-MSG 10 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 值 6.8～7.0，于121℃条件下灭菌20 min。用于培养生物转化用细胞。

1.3 方法

1.3.1 菌种培养与菌悬液的制备

取保藏菌种，按1%接种量接种于含有6 mL的PSB培养液的试管中，于37℃条件下静置培养24 h。活化后，将菌种按1%接种量再接入30 mL的PSB培养液的三角瓶中，制得种子培养液。按照2%的接种量，接种于200 mL的PSB液体培养基，于37℃条件下静置培养。

每100mL发酵液于4℃条件下，以转速10000r/min离心10 min，用10 mL的生理盐水洗涤菌体2次，然后再加10 mL生理盐水制成菌悬液。所得菌悬液，平均分为2组，一组用作细胞转化反应；另一组在冰浴条件下超声波破碎20 min（每次5 s工作，10 s间歇），破碎后在4℃下以转速10 000 r/min离心5 min，取上清液用作粗酶液。

1.3.2 不同pH值对P48细胞转化和粗酶转化活性的影响

L-MSG溶解于0.4 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液，分别配制成pH值分别为2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5的200 mmol/L L-谷氨酸—钠底物溶液。分别加入菌悬液和粗酶液进行反应。反应体系总体积4 mL，含2 mL蒸馏水、1 mL菌悬液（或粗酶液）和1 mL底物溶液。置于37℃水浴中反应，5 h后取样。

1.3.3 不同温度对P48细胞转化和粗酶转化活性的影响

在底物溶液浓度为200 mmol/L，于pH值4.5条件下进行细胞和粗酶液反应，分别置于25，30，35，40，45，50℃的条件下反应5 h后取样。

1.3.4 不同底物浓度对P48细胞转化和粗酶转化活性的影响

在温度40℃，pH值4.5的条件下，分别采用25，50，75，100，150 mmol/L的初始底物浓度进行细胞和粗酶转化反应，反应5 h后取样。

1.3.5 不同产物浓度对P48细胞转化和粗酶转化活性的影响

在初始反应体系中加入不同量的GABA，使GABA初始浓度分别为5，10，20，40，60，80 mmol/L。按上述试验所得最佳条件，分别进行细胞和粗酶液反应，转化5 h后取样。

1.3.6 GABA含量的测定

参照文献[7]采用高效液相色谱法对转化液中的GABA进行定量分析。

2 结果与分析

2.1 pH值对P48细胞转化和粗酶转化反应活性的影响

在不同的pH值条件下分别测定P48细胞菌悬液及其粗酶液转化反应所得的GABA含量。

pH值对P48细胞转化和粗酶液活性的影响见图1。

图1 pH值对P48细胞转化和粗酶液活性的影响

由图1可知，在使用粗酶液的转化反应中，P48粗酶的最适pH值为5.0。而在P48细胞转化反应中，pH值3.5～4.0时的GABA产量快速上升；在pH值4.0～5.5，虽然其产量有下降，但下降较为缓慢；pH值达到6.0时，其GABA的产量仍保持在60%，因此P48细胞转化反应的最适pH值为4.0。对比2组曲线，在各自反应的最适pH值条件下，采用粗酶液转化的GABA产量比采用细胞的高。由于GAD是胞内酶，利用细胞转化制备GABA时，底物需通过运送蛋白（Antiporter）运送到细胞内，在胞质经GAD发生脱羧反应生成GABA，生成的GABA再由运送蛋白运送出细胞外[5]。细胞转化过程在一定程度上受底物和产物传质阻力的影响，而粗酶液组中的GAD可直接与体系中的底物反应，因此采用粗酶液的GABA产量较细胞转化高。从维持高酶活的pH值范围来看，细胞转化反应在pH值4.0～5.5时，GABA的产量相差不大，而粗酶液组在pH值高于或低于5.0，GABA的产量都急剧下降，可见P48细胞菌悬液组适应的pH范围更宽广。当外界环境的pH值发生变化时，细胞内的pH值仍能维持一定的生理平衡，因此胞内GAD的活性受pH值的影响较低。而粗酶液的GAD经细胞破碎后释放到胞外，失去了细胞的保护，对pH值的变化较为敏感。P48细胞适应pH值范围更宽，有利于生产条件的调控，更适用于大规模生产。

2.2 温度对P48细胞转化和粗酶转化反应的影响

温度对P48细胞转化和粗酶转化反应的影响见图2。

图2 温度对P48细胞转化和粗酶转化反应的影响

由图2可知，P48粗酶转化的最适温度为40℃。P48细胞转化反应的GABA产量在25～45℃时不断增长，温度超过45℃后，其产量有所降低，但降低幅度不大。50℃时，产量仍保持70%左右，所以P48细胞菌悬液组的反应最适温度为45℃。对比2组曲线，温度高于或低于40℃时，使用粗酶的反应GABA产量都下降很快，温度达到50℃时，转化液中的GABA产量降到了40%，采用粗酶反应对温度较敏感，受温度的影响大。而在细胞反应中40～50℃时，GABA的产量差异不大，温度达到50℃时，产量仍有70%。由此可见，采用细胞进行转化反应有更宽的温度耐受范围。从已有文献看，龚福明等人[8]报道植物乳杆菌YM-4-3发酵法制备GABA的最佳温度为35℃，李理[9]研究了植物乳杆菌ATCC14917发酵制备GABA的最佳温度为40℃，渠岩等人[10]对研究了酱油后酵中植物乳杆菌S35发酵产GABA的条件，报道其最佳反应温度为35℃。试验结果表明，植物乳杆菌P48转化制备GABA最适温度45℃比上述的植物乳杆菌菌株的略高，说明P48在转化过程中的GAD活性能耐受较高温度，可以在较高温度条件下进行转化反应，在一定程度上可以抑制转化体系中常见的杂菌生长，更有利于实际的大规模生产。

2.3 底物浓度对P48细胞转化和粗酶转化反应的影响

底物浓度对P48细胞转化和粗酶转化反应的影响见图3。

图3 底物浓度对P48细胞转化和粗酶转化反应的影响

当底物浓度为25～50 mmol/L时，粗酶转化液中的GABA产量随底物浓度的增大而增加较快，当底物浓度大于50 mmol/L后，GABA的产量随底物浓度增大而减少，底物浓度达到150 mmol/L时，GABA降低到了60%以下，因此P48粗酶液的最佳反应底物浓度为50 mmol/L。在P48细胞转化反应在底物浓度为25～100 mmol/L时，转化液中的GABA含量亦随着底物浓度增大而增大。当底物浓度大于100 mmol/L后，GABA产量开始下降，但下降速度缓慢，底物浓度为150 mmol/L时，GABA产量仍有80%，所以P48细胞反应的最适底物浓度为100 mmol/L。对比2组曲线，2组的最高产量相差不大。但2组最适底物浓度不一样，而且细胞反应组在底物浓度75～150 mmol/L时产量仍保持80%。而粗酶反应组的GABA产量一直呈下降趋势。底物浓度过高时对酶有抑制作用，过量的底物分子可作为反竞争性抑制剂。当粗酶液的底物浓度达到体系最大承受容量时，转化反应会受到抑制作用。而细胞转化反应中由于细胞的保护作用，限制了底物的进入量，从而减低了底物对GAD的抑制，细胞转化反应的GAD酶活受底物抑制程度较低。因此，利用细胞转化反应制备GABA，可以用更高浓度的底物，减少投料次数，省时省力并且可以减少生产成本，更适合用于大规模生产GABA。

2.4 产物浓度对P48细胞转化和粗酶转化反应的影响

产物浓度对P48细胞转化和粗酶转化反应的影响见图4。

GABA的初始浓度为0～20 mmol/L时，粗酶转化液中的GABA逐渐增加，当GABA的浓度大于20 mmol/L时，转化液中的GABA产量明显下降，所以粗酶液转化反应最适底物浓度为20 mmol/L。而P48细胞转化组，当底物浓度大于或小于20 mmol/L时，其转化液中的GABA的产量都下降，所以其最适产物浓度也为20 mmol/L。可见低浓度的产物有利于进行转化反应。但是，当产物的量过高，反应体系达到饱和状态，反应速度会减缓甚至可能出现停止的情况。通过对比发现，产物浓度在20～40 mmol/L时，转化液中的GABA产量开始下降，但是细胞转化反应组下降速度较缓慢。当体系的产物浓度逐渐增大，反应易出现反馈抑制。过多的产物分子可作为变构剂抑制GAD的活性，从而使得新生成的GABA含量减少。未加入GABA前，粗酶转化液中的GABA含量比细胞菌悬液组要高，导致粗酶转化反应受产物的抑制作用较大，而细胞转化反应中由于细胞的保护作用使得转化反应受产物浓度影响较小。由以上分析可知，P48菌悬液适合用于大规模生产GABA，转化体系可以容纳更高浓度的产物。

图4 产物浓度对P48细胞转化和粗酶转化反应的影响

3 结论

采用植物乳杆菌P48细胞生物转化制备GABA，试验结果发现，细胞转化反应的最适pH值为4.0，最适反应温度45℃，加入的底物浓度100 mmol/L，加入的底物量较高，当产物浓度大于20 mmol/L时有产物抑制现象。试验得到的P48细胞转化条件，可在温度较高条件下进行反应，有利于大规模生产时减少杂菌污染的影响；P48转化反应能采用较高的起始底物浓度，有利用利于减少投料次数，降低生产成本，利于促进转化反应的进行，增加GABA的产量。这为利用植物乳杆菌P48细胞大规模转化制备GABA提供了实际的参考数据。