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与ADHD相关的外周循环microRNA芯片筛选及分析

2019-06-24吴丽慧

医学研究杂志 2019年5期
关键词:定量外周血引物

朱 萍 潘 景 张 帆 吴丽慧

注意缺陷多动障碍(attention-deficit hyperactivity disorder,ADHD)是以注意力不集中、活动过度、冲动为特征的一种神经行为障碍,并伴有认知障碍和学习困难[1]。在全球儿童中的发生率约3%~5%,而60%~80%患儿的症状可持续至青少年或者成年,是儿童常见的神经精神障碍之一。目前ADHD的发病机制与病因比较复杂,还尚不明确,但多数研究者认为是遗传因素与环境因素相互作用的结果,同时也与大脑结构与功能异常有关。ADHD的主要诊断依据美国精神病学会《精神障碍诊断与统计手册》第5版(DSM-V)儿童ADHD临床诊断标准,即问卷调查的方式[1]。目前还没有可靠的分子诊断标记。

非编码小RNA(microRNA, miRNA)通常源于1个大小约为1000bp的长链RNA初始转录产物(pri-miRNA),pri-miRNA分子在细胞中经过双链RNA特异性RNsae Ⅲ-drosha的作用下形成70~100nt具有茎环结构的前体microRNA (pre-miRNA)。Pre-miRNA在exportion-5的作用下转运至胞质中,被另一个双链RNA特异性RNsae Ⅲ-dicer识别,进一步切割成为成熟miRNA。miRNA与肿瘤、心血管疾病、糖尿病、人类遗传性疾病甚至神经系统重大疾病的发生、发展密切相关。在中枢神经系统中miRNA含量特别丰富,其功能涉及神经发育、分化、退行性变、凋亡等,同时也涉及记忆、精神发育迟缓等方面,但miRNA在神经发育与活动中的作用还存在广泛的未知性[2,3]。研究报道帕金森综合征患者的血清中miR-133b,脑皮质组织中miR-205,表达量是显著降低的;重度抑郁患者外周血中miR-132表达量增加,并且是通过结合在甲基-CpG结合蛋白(MeCP2)和脑源性神经营养因子(BDNF)的mRNA上的3′非翻译区(3′UTR),使MeCP2、BDNF表达下降,从而影响重度抑郁症的发生、发展[4~6]。因此笔者猜测,和正常儿童比较,ADHD患儿外周循环中是否可能存在一组miRNA表达量有显著性差异,这些改变的miRNA可能成为ADHD潜在的诊断标记,故本研究采用miRNA 芯片技术筛选出在ADHD患儿外周血清中差异表达的miRNA。

对象与方法

1.研究对象:实验样本来自2015年10月~2016年2月在笔者医院就诊的ADHD患儿20例,符合实验标准的健康儿童60例。按照年龄和性别配对形成ADHD儿童∶正常儿童=1∶3的病例组20对。(1)病例组(ADHD)儿童纳入标准:①6~18岁儿童;②根据美国精神病学会《精神障碍诊断与统计手册》第5版(DSM-V)儿童ADHD临床诊断标准,排除精神发育迟缓、品行障碍、情绪障碍、学习障碍及各种精神疾病等;③通过详细的体格检查、神经系统检查、精神状况检查与相关实验室辅助检查,排除躯体疾病及神经系统疾病;④智商>70;⑤班主任综合评定认为在语文和数学方面无明显的学习困难,期末考试成绩在全班平均成绩减1个标准差以上;⑥近2周内未使用精神药物治疗。(2)对照组(非ADHD组)儿童的纳入标准: 通过详细的体格检查、神经系统检查、精神状况检查与相关实验室辅助检查,排除精神发育迟缓、品行障碍、情绪障碍、学习障碍及各种精神疾病,排除躯体疾病及神经系统疾病的健康儿童。该研究遵守《赫尔辛基宣言》,通过了笔者医院医学伦理学委员会批准。该研究的目的、方法、可能后果及健康保证均向儿童监护人交待清楚,所有监护人均签署知情同意书。

2.标本收集:ADHD儿童和正常儿童采血前休息20~30min,通过肘静脉采血4ml,室温静止1h,4℃ 10000r/min,离心10min,用取样器将上清液(血清)吸取到无菌试管,血清标本储存于-80℃冰箱。

3.microRNA 芯片筛选差异表达microRNA:所有样本都用miRcute血清/血浆miRNA提取分离试剂盒(北京天根生化公司)抽提总RNA,使用美国Agilent公司人miRNA芯片V21.0(agilent human miRNA microarray V21.0)测试各组microRNA的表达量,该微阵列取自miRBase 21版数据库,包含2549条人类miRNA的探针。每一张载玻片上包含8个单独的微阵列,每个具有1900个功能。阵列包括48个阴性对照,用于估计荧光背景和背景差异,每个微阵列的样品量为100ng,用Cy3标记后,每张载玻片经 XDR Scan (PMT100,PMT5)扫描得到信号。打开agilent scan control software扫描芯片获得miRNA的信号图像,用agilent feature extraction(AFE) software version 10.7.1.1分析可以得到所有的芯片和miRNA信号值。这些信号经消除背景后登陆SBC analysis system(http://sas.ebioservice.com)进行统计分析。选择hsa-miR-1273g-3p为内参,原因为,①在所有样本内均有检出;②标准差(SD)较小,在样本间变化幅度小;③平均信号值较高,一般认为>30的信号值(log2后约为>5)相对更可靠,因此选用该内参进行校正。

4.实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)验证:(1)引物设计:对改变量>2倍的miRNA进行实时荧光定量PCR验证,根据miRNA序列设计引物(引物由苏州泓迅生物科技股份有限公司合成,miR-30d-5p反转录引物:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTTCCA-3′,检测引物:5′-GTTGTTGTAAACATCC-3′; miR-4655-3p反转录引物:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCCCG-G-3′,检测引物:5′-TGTTGACCCTCGTCA-3′; miR-7641发转录引物:5′-GTCGTATCCAGTGC-AGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCTTAG-3′,检测引物:5′-CTCGTTTGATCTCGG-3′;内参miR-1273g-3p反转录引物:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTCAG-GC-3′,检测引物:5′-TCTAGTAACCACTGCACTC-3′,这4个miRNA在进行PCR检测时均用miR-223a作为反向互补链5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′)。(2)RT:将抽提的血清总RNA通过反转录酶(M-MLV,日本TaKaRa公司)获得cDNA. RT体系及条件为:先加样Ⅰ体系(RNA 5μl,无菌水5μl,反转录引物1μl,内参引物1μl)混匀后,反应条件为70℃,10min,冰上5min;再加样Ⅱ体系(5×RT buffer 4μl,10mol/L dNTP 1μl,无菌水2μl,M-MLV 1μl)混匀后,反应条件为30℃ 10min,42℃ 60min,70℃ 10min。(3)定量PCR: cDNA通过探针法实时监测PCR过程,最后用2-ΔΔCt法对基因表达进行相对定量。定量PCR体系及条件:2×Taqman Mix(CW0932S,康为世纪)5μl,引物(40μmol/L)0.0625μl+0.0626μl,通用探针0.125μl,无菌水3.25μl,cDNA1.5μl,反应条件95℃预变性10min,95℃ 15s,60℃ 1min。50个循环。

4.统计学方法:芯片结果选择内参miR1273g-3p在所有样本内的中位值为基准,将所有信号值减去该值。把对照组3个信号值取平均值后与ADHD患儿组进行配对T检验,实时荧光定量PCR结果也采用配对T检验分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.microRNA 芯片初筛结果:同对照组60例健康儿童比较,在年龄相仿、性别一致的情况下,ADHD患儿血清中miR-30d-5p、miR-19b-3p,miR-6085、miR-19b-3p、miR-6749-5p、miR-6826-5p、miR-3960等61个microRNA的表达量在20例ADHD患儿中均有改变(表1)。其中改变量>2倍即fold change<0.5的是 miR-30d-5p, miR-4655-3p和miR-7641,表1中前3个,这3个miRNA在各样本中的信号值(图1),上方文本为样本编号,左侧文本为microRNA(探针)编号,每一行代表1个基因(探针),每一列表示1个样本。颜色越红代表miRNA在对应样本中的表达量越高,颜色越蓝代表miRNA在对应样本中的表达量越低。

表1 ADHD相关的外周循环microRNA芯片筛选

图1 miR-30d-5p、miR-4655-3p、miR-7641热图

2.实时荧光定量PCR验证:将实验组(20例ADHD患儿)和对照组(60例健康儿童)的芯片结果表达量改变>2倍的miR-30d-5p、 miR-4655-3p和 miR-7641在上述80例样本中进行实时荧光定量PCR验证,结果显示,和对照组比较,miR-30d-5p、 miR-4655-3p和 miR-7641在ADHD患儿外周血清中相对表达量降低(P=0.000),与芯片筛选出的miRNA在ADHD中的表达趋势一致(图2)。

图2 被筛选的miRNA在ADHD中的表达趋势A.miRNA-30d-5p的相对表达量;B.miRNA-4655-3p的相对表达量;C.miRNA-7641的相对表达量

讨 论

ADHD是儿童最常见的神经精神障碍之一,主要表现为注意力不集中、多动和冲动,可分为注意力缺陷型、多动/冲动型和混合型,发病可延续到成年。美国儿科学会(American Academy of Pediatrics,AAP)2011年版ADHD指南指出,初级保健医生应当认识到ADHD是一种慢性状态,有着特殊的保健需要,若没有维持长期治疗,将会造成很大影响。其原因在于其有发展为破坏和过度冒险行为,品行障碍,学习困难,情感问题的潜在风险,而这些非核心症状将影响到儿童各个方面如学业成就、成长及生活质量,给自身、学校、家庭和社会带来极大负面影响[7]。迄今为止,ADHD的发病机制和病因未能完全清楚,大多数研究者认为中枢神经系统中多巴胺能、5-羟色胺能(5-HT)、去甲肾上腺素能的异常表达是ADHD的主要发病机制,而ADHD的主要诊断也是依据量表的形式,无分子诊断标记[8~10]。

miRNA参与控制许多细胞/分子过程,如细胞凋亡、增殖和分化[11, 12]。近年来,研究发现miRNA在中枢神经系统中含量特别丰富,其功能涉及神经发育、分化、退行性变、凋亡等,同时也涉及记忆、精神发育迟缓等方面。本课题组首先利用ADHD大鼠模型SHR和正常对照模型Wistar Kyoto(WKY)大鼠比较,测得SHR的脑前额区(PFC)存在半乳凝素3(Galectin-3)及miR-let-7d的表达异常,并且发现miR-let-7d直接作用于Galectin-3的3′UTR从而负性调控Galectin-3的表达,同时Galectin-3的降低能抑制TH的表达,而TH是多巴胺代谢过程的关键酶[13]。为此笔者进一步收集了35例ADHD患儿和35例门诊体检儿童,检测到血清miR-let-7d的水平在ADHD组明显高于对照组;在所收集到的ADHD患儿中,混合型占60%之多,因此推测miR-let-7d的高表达在混合型可能更加突出[14]。笔者还利用ADHD大鼠模型发现了和对照组WKY大鼠比较,SHR的前额皮质区域的miR-34c*、miR-138、miR-138*、miR-296和miR-494表达显著下降,经过启动子序列分析和活性测定,确定了糖皮质激素受体(Nr3c1)能够使miR-34c *、miR-138-1、miR-296和miR-494基因的启动子活性及其转录得到抑制。同时测得在SHR的PFC中,Nr3c1表达异常升高。另一方面,笔者还通过荧光素酶报告得到miR-34c*、miR-138、miR-138*、miR-296和miR-494能结合在转录因子Bhlhb2(Bhlhe40)信使RNA(mRNA)的3′非翻译区上,从而抑制了Bhlhb2基因的表达。同样地,Bhlhb2表达在ADHD模型SHR的PFC中也显著高于对照。

为了进一步观察Bhlhb2在SHR体内的作用,与对照组比较,敲除Bhlhb2基因能显著改善SHR的活动过度[15]。这些研究结果表明,Nr3c1-Bhlhb2轴失调参与了注意力缺陷和多动症的发展。结合本课题之前研究,认为存在一组miRNA在ADHD上是有表达差异的,笔者想从ADHD患儿获得直接的证据。故本研究通过基因芯片技术,在年龄和性别一样的条件下,ADHD患儿外周血清中有61个miRNA较正常儿童降低,取fold change>2倍的miR-30d-5p、miR-4655-3p、miR-7641进行实时荧光定量PCR验证,趋势同芯片结果一致。但是这些差异miRNA与ADHD之间的相互作用还有待进一步研究,有研究报道miR-30d-5p在阿尔兹海默症患者外周血中表达量升高,并且与亨廷顿舞蹈病有关,目前还没有研究miR-4655-3p与miR-7641在神经系统疾病的报道[16,17]。笔者猜测这些差异miRNA可能通过调控靶基因来影响ADHD的病情发展。

综上所述,miR-30d-5p、miR-4655-3p和miR-7641在ADHD患者外周血清中降低明显,因此认为这3个miRNA有可能作为临床诊断ADHD的指标之一,但是由于本研究中样本数量有限,后续实验笔者将扩大样本量,验证结果的可靠性,以及差异miRNA是否会随着ADHD病情好转或者药物治疗后表达量改变,有待后续追踪随访情况。同时笔者将着重于预测靶基因,查阅相关文献分析靶基因功能,探讨miRNA靶基因与ADHD之间可能存在的潜在关系。

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