吴思霖，王欣美，潘 晨，于 建，张 凯，王 柯，郑 荣

(上海市食品药品检验所，上海 201203)

铬(Cr)在自然界中主要以Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)两种形态存在。Cr(Ⅲ)是生物体必需的微量元素，而Cr(Ⅵ)的毒性比Cr(Ⅲ)高100倍，为致畸致癌物质[1-2]，易被人体吸收并在体内蓄积。世界卫生组织国际癌症研究署(IARC)已将Cr(Ⅵ)列为致癌物质[3]。不同价态的铬毒性差别较大，因此仅对铬做总量分析不够完善。由于Cr(Ⅵ)的高致畸致癌性，化妆品安全技术规范(2015年版)中规定铬、铬酸及其盐类(以Cr(Ⅵ)计)为禁用组分，但目前国家尚未制定Cr(Ⅵ)的相关限值。Cr(Ⅵ)在酸性条件下易转变为Cr(Ⅲ)[4-6]，因此有必要建立一种同时分析Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的方法，为化妆品中铬的风险评估、相关限值制定奠定基础。

目前，国内对Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)同时检测的研究主要集中在玩具[4-5]、食品[7-8]、饮用水[9-10]等领域，对化妆品中铬价态的研究较少且以检测总铬为主，尚缺乏化妆品中铬价态检测的技术标准。检测Cr(Ⅵ)或同时检测Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的方法有原子吸收光谱法[11-13]、离子色谱法[14]及色谱-质谱联用法[15-17]等，其中高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术(HPLC-ICP-MS)具有灵敏度高、检出限低、线性范围宽等优点，近年来已成为形态分析中最具应用前景的技术。

然而文献多采用酸性溶液提取Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)[4]，将其应用于化妆品中Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的提取时重现性较差，且Cr(Ⅵ)在酸性条件下易转变为Cr(Ⅲ)，较难适用于不同基质类型化妆品中Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的同时测定。本文通过优化质谱、色谱及提取条件等，建立了同时检测化妆品中Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的HPLC-ICP-MS分析方法，旨在为化妆品的安全监管提供必要的技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

7700型电感耦合等离子体质谱仪、1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；WNB10-45 型恒温水浴摇床(美墨尔特上海贸易有限公司)；5810R型高速离心机(德国Eppendorf公司)；DELTA 320 型 pH 计(瑞士Mettler公司)；Milli-Q Advantage A10超纯水仪(美国Millipore公司)。

Cr(Ⅵ)标准溶液(1 000 mg/L，国家有色金属及电子材料分析测试中心)；Cr(Ⅲ)标准溶液(1 000 mg/L，国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院)；硝酸(色谱纯,德国 Merck公司)；EDTA、氢氧化钠、氨水(均为分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)；实验用水为超纯水(18.2 MΩ·cm)。

混合标准溶液：分别精密移取Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)标准溶液适量，用10 mmol/L EDTA溶液(pH 7.0，NaOH调节)稀释，配制质量浓度为 1 μg/mL的混合标准溶液，于 50 ℃ 水浴中加热60 min，使Cr(Ⅲ)与 EDTA 完全络合。

1.2 检测条件

1.2.1 色谱条件色谱柱：Agilent Bio-WAX柱(4.6 mm × 50 mm，5 μm)；柱温：室温；流动相：0.075 mol/L 硝酸(pH 7.0，氨水调节)；洗脱方式：等度洗脱；进样量：40 μL；流速：1.0 mL/min。

1.2.2 质谱条件高频等离子体发射功率：1 550 W；载气：氩气(99.999%)；载气流量：0.8 L/min；载气补偿气流量：0.4 L/min；氦反应碰撞模式；氦气流量：4.0 mL/min；采样锥/截取锥：Pt锥；采样深度：8.0 mm；蠕动泵：0.4 r/min。采集质量数：铬52；积分时间：0.8 s；采集时间：180 s。

1.3 样液的制备

称取0.5 g 样品置于10 mL 离心管中，加入10 mL 10 mmol/L EDTA(pH 7.0，NaOH调节)，涡旋混匀后于 50 ℃水浴中加热60 min，使Cr(Ⅲ)与 EDTA 完全络合，冷却，取部分溶液以 10 000 r/min 离心5 min，取上清液过0.45 μm滤膜，备用。同时，按相同操作方法做空白试验。

图1 Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)混合标准溶液(10 μg·L-1)的HPLC-ICP-MS图Fig.1 HPLC-ICP-MS chromatogram of Cr(Ⅵ) and Cr(Ⅲ)(10 μg·L-1) mixed standard solution

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

使用Agilent调谐液(Li、Y、Co、Ce 和Tl的质量浓度为1 μg/L)对仪器进行调谐，使仪器的灵敏度和稳定性最佳。调节碰撞反应气流速，以消除质谱检测中40Ar12C+与35Cl16O1H+对52Cr+的光谱学干扰，同时优化载气流量、补偿气流量及采样深度等，以提高仪器灵敏度，并使氧化物和双电荷的比率符合仪器推荐的要求，优化的质谱条件见“1.2.2”。

2.2 色谱柱的选择

文献中采用C18[8]、C8色谱柱[5]和阴离子色谱柱[6]均可实现Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的分离，但使用C18、C8色谱柱分离时，流动相中需加入离子对试剂，对色谱柱损伤较大[18]。而阴离子色谱柱耐受性强，应用广泛，因此本实验选用阴离子色谱柱Agilent Bio-WAX柱(4.6 mm×50 mm，5 μm)，对10 μg/L Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)混合标准溶液进行分离。结果显示，Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)在3 min内实现了基线分离，且峰形尖锐，分离度好(见图1)。

2.3 pH值的影响

Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)在不同 pH 条件下的稳定性有较大差异。实验发现，当 pH>8.0时，Cr(Ⅲ)的响应信号随时间延长而逐渐降低；当pH<6.0时，Cr(Ⅵ)的响应信号随时间延长而逐渐降低，且16 h后其信号损失高达50%。这是由于在碱性条件下，Cr(Ⅲ)易水解生成沉淀，而在酸性条件下，Cr(Ⅵ)易转化为Cr(Ⅲ)[4-6]。当pH为6.0～8.0时，Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)相对稳定，但随着 pH值的升高，Cr(Ⅵ)的保留时间缩短，分离度降低。因此，综合考虑分离度及分析过程的稳定性，选择流动相及提取溶剂的pH值为7.0。

2.4 前处理条件的优化

2.4.2 EDTA浓度的影响分别用0.1、0.5、1、5、10、50、100 mmol/L的EDTA(pH 7.0，NaOH调节)配制1 μg/mL Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)混合标准溶液，考察EDTA浓度对Cr(Ⅲ)与Cr(Ⅵ)分离情况的影响。结果表明，随着EDTA浓度的增加，Cr(Ⅵ)的峰面积无显著变化，但保留时间逐渐缩短，Cr(Ⅲ)的峰面积逐渐增大至稳定，两峰的分离度逐渐降低。当EDTA浓度为10 mmol/L时，Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的响应高且分离效果好，因此选择EDTA的最佳浓度为10 mmol/L。

2.4.3 络合温度的影响Cr(Ⅲ)与 EDTA 在常温下络合缓慢，需数十小时才能络合完全，且升高温度可加快络合速度[17]。以10 mmol/L EDTA(pH 7.0，NaOH调节)配制 1 μg/mL的 Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)混合标准溶液，分别置于 30、40、50、60、70、80 ℃的水浴中 60 min，考察温度对Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)响应及稳定性的影响。结果表明，随着温度的升高，Cr(Ⅵ)的响应信号无明显变化；Cr(Ⅲ)的响应逐渐增加，但温度达70 ℃后其响应信号显著下降。综合考虑，选择50 ℃为最佳络合温度，此时Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的响应均较高。

2.4.4 络合时间的影响以10 mmol/L EDTA(pH 7.0，NaOH调节)配制1 μg/mL的 Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)混合标准溶液，置于50 ℃水浴中分别络合15、30、45、60、90、120 min后进行测定。结果表明，随着络合时间的延长，Cr(Ⅲ)的响应信号逐渐增大，60 min后其响应信号趋于稳定，表明此时Cr(Ⅲ)与EDTA 已络合完全，而络合时间对Cr(Ⅵ)的响应信号无显著影响，因此选择最佳络合时间为60 min。

2.5 线性关系、检出限及定量下限

以10 mmol/L EDTA(pH 7.0，NaOH调节)将Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的混合标准溶液(1 μg/mL)稀释成 1、5、10、20、50、100 μg/L的混合标准工作溶液，在优化条件下采用本方法进行测定，以各组分的质量浓度(x，μg/L)为横坐标，响应值(y)为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)均在0～100 μg/L质量浓度范围内线性关系良好，相关系数(r2)均为0.999 9，回归方程分别为y=48 471.2x+44 530和y=46 817.2x+305 144。以色谱峰信噪比(S/N)为3时所对应的浓度计算检出限(LOD)，以S/N为10时所对应的浓度计算定量下限(LOQ)，当进样量为40 μL时，Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的LOD分别为6、2 μg/kg，LOQ分别为18、6 μg/kg。

2.6 加标回收率与相对标准偏差

选用液态水基类、膏霜乳液类及粉类3种基质的空白样品，分别添加100、400、1 000 μg/kg的Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)混合标准溶液，按照本方法进行测定。得到3个加标水平下Cr(Ⅵ)的回收率为85.3% ～101%，相对标准偏差(RSD，n=6)为0.4%～2.5%；Cr(Ⅲ)的回收率为85.1%～113%，RSD(n=6)为0.5%～4.6%，方法的准确度和精密度良好。

图2 粉类基质样品(powder-10)的色谱图Fig.2 Chromatogram of powder cosmetics sample(powder-10)

2.7 实际样品的检测

按照上述方法对液态水基类、膏霜乳液类及粉类3种基质的30批次实际样品进行测定，液态水基类样品均未检出Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)；2个膏霜乳液类样品检出Cr(Ⅲ)，含量分别为49.90、9.92 μg/kg；5个粉类样品检出Cr(Ⅲ)，含量为2.28～155.79 μg/kg；1个粉类样品同时检出Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)，含量分别为143.20、23.28 μg/kg，该样品(Powder-10)的色谱图见图2。结果显示，实验所选取的化妆品样品中铬多以Cr(Ⅲ)形态存在，部分样品检出Cr(Ⅵ)。

3 结 论

本研究建立了HPLC-ICP-MS同时测定化妆品中Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的分析方法。考察了pH值、提取溶剂、EDTA浓度、络合温度及络合时间等条件的影响，最终确定以10 mmol/L(pH 7)的EDTA溶液为提取溶剂，在50 ℃下络合60 min。在优化实验条件下，Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的线性范围为0～100 μg/L，相关系数(r2)均为0.999 9，检出限分别为6、2 μg/kg，加标回收率为85.1%～113%，RSD为0.4% ～ 4.6%。该方法样品前处理简单，重现性好，回收率高，适用于化妆品中Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)的定量分析，可为化妆品中铬的风险评估、相关限值制定奠定基础。