刘 察，臧颖超，曾惠桃，范夏琼，张志敏，卢红梅

(中南大学 化学化学工学院，湖南 长沙 410083)

拉曼光谱技术是一种重要的分析检测技术，广泛应用于各种领域，如古文物鉴定、生物蛋白质研究、医药物质检测、食物安全现场检测等[1]。该技术无需复杂的样本预处理，几乎可以用于任何环境[2]。拉曼光谱还包含了丰富的物质结构信息，被称为分子的“指纹图谱”[3]。采用适当的化学计量学方法，可获取隐藏在拉曼光谱中的定性和定量信息，从而实现对待测物质的定性检测和定量分析。由于常规拉曼散射光强度约为入射光强度的10-6～10-9，这极大限制了拉曼技术的应用和发展。表面增强拉曼光谱技术(Surface enhanced Raman spectroscopy，SERS)利用具有纳米级粗糙度表面的金、银等金属可将拉曼信号放大一百万倍的特性[4-5]，设计了一系列金、银以及复合金属材料基底以显著增强物质拉曼信号[6-7]，使得SERS在分子检测中具有良好的发展前景。

甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)是一种抑制肿瘤细胞生长的抗叶酸类抗肿瘤药，可通过抑制二氢叶酸还原酶而降低四氢叶酸的形成并阻断DNA 的合成，有效抑制滑膜细胞及免疫炎症细胞的增殖，从而起到免疫抑制、抗炎、抗风湿的作用，主要应用于癌症的治疗。伏立康唑(Voriconazole，VOR)是一种通过抑制真菌中由细胞色素P450介导的14α-甾醇去甲基化，从而抑制麦角甾醇的生物合成的广谱抗真菌药，对人和动物的真菌感染均有治疗作用。临床医疗研究发现：MTX和VOR两种药物不同比例的混用会对小儿肿瘤患者产生强烈的副作用，并严重损害小儿肿瘤患者的皮肤。目前拉曼光谱技术可实现对VOR的检测分析。MTX固体的拉曼光谱图无法获取，实验发现，低功率的激光照射条件下，MTX物质即出现灼烧情况。在VOR和MTX混合物的拉曼光谱中，VOR的拉曼光谱强度信号极低，难以找到特征拉曼光谱峰进行鉴定分析。而且2种混合物的拉曼光谱存在重叠峰干扰，无法获得特征光谱而使混合物的定性定量分析困难[8-9]。针对此问题，可采用化学计量学中的信号预处理算法以增强拉曼光谱分辨率，消除基线效应[10-13]。Eiler等则提出一种高效算法，通过平滑分析信号，以实现对峰位置的检测[14-15]。Zhang等基于小波多分辨的优势，提出了小波空间多尺度峰检测方法(Multi-scale peak detection，MSPD)[16]，该方法利用小波空间中的脊线、峰谷、零交叉点等信息进行峰位置估计，并通过调整遗传算法迭代次数和种群个数，得到峰位置和峰宽的最优解[17]。彭颖等将MSPD方法与SERS技术相结合用于食品中违禁色素检测，得到很好的实验结果[18]。

本文针对MTX和VOX混合物快速定性检测与半定量分析中存在的问题，合成了一种金纳米颗粒复合物(AuNPS-PPDA)作为SERS基底，利用SERS技术可获得MTX和VOX混合物的高质量光谱。针对SERS光谱重叠的问题，本文提出了小波空间特征匹配(Feature matching in wavelet space,FMWS)方法，通过该方法可显著减轻信号中基线变化和随机噪声的影响，从而实现对混合物中目标物质的识别，及定性和半定量分析。

图1 FMWS算法的流程图
Fig.1 The procedure of FMWS

1 原 理

本文提出FMWS算法(见图1)，该方法基于CWT原理进行峰检测，通过综合运用小波空间信息可准确检测特征峰位置，实现对物质的定性检测。再提取特征峰强、峰面积等信息，基于非负最小二乘算法实现对甲氨喋林和伏立康唑的半定量分析。

1.1 连续小波变换峰检测

小波是基于一系列具有连续可微、零均值等特性的函数基础上形成的多尺度信号分析方法，其表达式如下：

(1)

式中，a为尺度因子，b为平移因子。可以看成是信号s(t)与小波函数Ψ的卷积，定义如下：

(2)

采用如下步骤可以利用CWT将SERS光谱转换至小波空间，并提取高质量特征：

①小波基的选择：由分析仪器产生的特征峰有较高的局部特征，色谱信号多为高斯峰，光谱信号多为洛伦兹峰，因此本研究选择的墨西哥帽函数具有近似对称、与高斯峰相似的特点，选择墨西哥帽小波作为小波函数；

②小波空间中的脊线、峰谷、零交叉点：在二维小波空间中，脊线、峰谷、零交叉点等重要特征参数可以很容易被确定；

③峰位置的确定：综合利用脊线、峰谷、零交叉点可确定峰位置、起始点；

④脊线阈值：通过脊线最大值设置阈值，去除假峰；

⑤峰强与峰面积的提取：通过提取峰强、峰面积等信息，用于后续小波空间特征匹配。

小波系数C为二维矩阵，行和列分别代表尺度因子和平移因子。将矩阵C分别平移k，k-1，...1以及-k，-(k-1)，...，-1列，分别作为矩阵kC和矩阵-kC。脊线、峰谷和零交叉点可通过以下的布尔代数方程得到：

R=(C>-kC)∧(C>-(k-1()C)...(C>k-1C)∧(C>kC)

V=(C<-kC)∧(C<-(k-1)C)...(C

Z=[sgn(c1)⊕sgn(c0),…sgn(cn)⊕sgn(cn-1)]

(3)

R，V，Z为分别包含脊线、峰谷和零交叉点信息的矩阵。取出R中的列计算元素和，如果列求和为0，则这一列没有脊线，如果列求和大于0，则这列中可能有脊线。然后从小尺度系数到大尺度系数增加行值,从初始位置扫描矩阵R。重复提取过程，直至矩阵R最后一行元素值全为0，则说明列中的脊线已经提取完全。若小波系数大于0，则为单峰。小波系数小于0，则可能为重叠峰。搜索矩阵V，Z进行双向搜索。遇到非0值时，作为峰的起止点，将搜索过程中非0值的列保存。在原始信号中，最大值列和最小值列分别对应峰的起止点，其间的最大值列对应峰的位置。

1.2 小波空间特征匹配

HQI是一种正向光谱检索方法，它以参考物光谱与未知光谱的匹配系数的大小，决定是否有特征物质存在。其HQI值越大，说明未知光谱与参考物光谱的相似度越高。该方法主要适用于纯物质光谱分析，而对混合物光谱，杂峰存在下的未知光谱的匹配则不稳健，其HQI值易受杂峰因素的干扰。FMWS算法则不受该因素限制，在检索未知光谱时，只选取对应特征峰强信息进行匹配，而自动忽略其他杂峰、重叠峰的干扰。其FMWS越接近于1，则说明未知光谱与参考物光谱越接近。

(4)

HL，HU∩L为向量，HU∩L为参考物光谱L与未知物对应的特征峰光谱U。HL，i为参考物光谱第i特征峰的特征匹配系数，HU∩L为参考物光谱L与未知物光谱U的第i特征匹配系数。

1.3 非负最小二乘半定量算法

本文研究的混合物光谱，y即为混合物光谱，X为矩阵，矩阵的列代表未知化合物。b为未知化合物在混合物中占比的向量。通过设置阈值可以消除杂质峰谱的干扰，用非负最小二乘算法可以实现对未知混合物组分的半定量分析。统一混合物与光谱库中可能存在组分的拉曼光谱积分时间，近似计算出混合物的比例。其表达式如下：

min‖y-Xb‖≥0,bi≥0

(5)

式中的非负最小二乘问题可等价于如下二次规划问题：

(6)

式中，Q=XTX，c=-XTy。本文基于Lawson和Hanson[19]提出的有效集非负最小二乘方法对混合物中的组分进行半定量分析。

2 实验部分

2.1 材料与仪器

氯金酸(HAuCl4·3H2O)、柠檬酸钠，聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)、MTX、VOR(分析纯，上海Sigma-Aldrich公司);实验所用超纯水(18.25 MΩ·cm)均来自Milli-Q净水系统(Bedford,MA,USA)。实验中未特别指明，均在室温下进行。

B&W Tek i-Raman拉曼光谱仪(B&W Tek Inc.,Newark,DE,USA)，激发光源波长为785 nm，激光功率为30 mW;拉曼位移范围为222～2 478 cm-1;Tescan MIRA 3 XMU SEM(Tescan USA Inc.,Cranberry Township,PA,USA)获取金纳米的微观形貌图。

2.2 金纳米颗粒的制备

金纳米粒子采用经典的柠檬酸钠还原氯金酸方法制备[20]：将1mL HAuCl4(1 mmol/L)快速加入已煮沸的50 mL 1%柠檬酸钠溶液中，在100 ℃条件下，磁力搅拌反应20 min，当混合溶液从浅黄色逐渐变为明亮的鲜红色后，停止反应，将混合液自然冷却并倒入用锡纸密封的锥形瓶中，完成50 nm的金纳米(AuNPS)制备[21]。同样条件下，将0.6 mL HAuCl4(1 mmol/L)快速加入已煮沸的50mL 1% 柠檬酸钠溶液中，自然冷却即得尺寸为70 nm的金纳米(AuNPS)。

2.3 AuNPS-PDDA纳米复合材料的制备

将1 mL PDDA与9 mL水置于烧杯中超声处理5 min，使其充分混合后，再量取30 mL AuNPS溶液至烧杯中。40 mL混合液在8 000 r/min转速离心机下离心15 min，移除上清液，得到2 mL AuNPS-PDDA。

2.4 MTX和VOR混合物的快速SERS检测

100 μL不同浓度的MTX和VOR样品与100 μL AuNPS-PDDA混合超声处理10 min,每次用移液枪移取10 μL混合液缓慢均匀滴于硅胶板上检测，每1批次滴5个样品做平行检测，光谱采集的时间为30 s，即得到MTX和VOR混合物的表面增强拉曼光谱图。

2.5 MTX和VOR混合物的浓度梯度实验

取0.1 mg/mL VOR(2.86 ×10-4mol/L)分别与不同MTX浓度(1.0×10-3、1.0×10-4、1.0×10-5、1.0×10-6、1.0×10-7、1.0×10-8mol/L)混合，得到6组混合物。每次移取10 μL样本滴于硅胶板上进行检测。

3 结果与讨论

3.1 金纳米颗粒形貌特征

图1A、B分别为50 nm和70 nm金纳米的扫描电镜图。由图可看出，50 nm的金纳米分散均匀，未出现团聚现象，而70 nm的金纳米粒子分散不均匀，且出现部分团聚，说明50 nm尺寸的金纳米稳定性能优于70 nm尺寸的金纳米，本实验采用50 nm尺寸的金纳米基底进行实验。

3.2 MTX和VOR的拉曼光谱图

由图3可以看出，VOR的常规拉曼图谱信号强度较低，只有2 500。借助表面增强拉曼光谱技术，其730 cm-1特征峰的强度值可大于10 000。其中，730 cm-1为季碳的伸缩振动峰，1 050 cm-1为环内NCN的伸缩振动峰。本实验用经典的柠檬酸钠还原氯金酸获取金纳米的方法，使用强阳离子聚电解质PDDA，得到带正电荷的金纳米基底，利用正负电荷结合的原理，采用碱液溶解药物可以使药物分子结合在金纳米表面。在入射光激发下，金纳米颗粒表现出强烈的表面等离子体共振特性。具有很强的局域电场，使得处于该电场中的MTX和VOR分子的拉曼散射被增强。因此可以得到药物分子信号显著增强的拉曼特征图谱。

图3 VOR的拉曼光谱及表面增强拉曼光谱Fig.3 Raman and SERS spectra of VOR

图4 MTX、VOR及MTX-VOR的表面增强拉曼光谱Fig.4 SERS spectra of VOR,MTX and MTX-VOR

图5 混合物中改变MTX浓度的表面增强拉曼光谱Fig.5 SERS spectra of mixture with different MTX concentrations

按“2.4”考察了MTX和VOR混合物的SERS谱图(见图4)。由图4可以看出：MTX和VOR纯物质的SERS光谱在MTX-VOR混合物的SERS光谱中均能找到，VOR的SERS光谱也可测出。说明借助SERS技术可以成功检测出MTX、VOR、MTX-VOR光谱。按“2.5”采用SERS技术进一步考察了MTX和VOR混合物的浓度梯度实验。从图5可看出，混合物中0.1 mg/mL VOR(2.86×10-4mol/L)与1.0×10-8mol/L MTX均可被成功识别。此外，采用SERS技术还可很容易地区分出混合物中各组分的拉曼特征峰，其中680 cm-1为MTX苯环上的C—H 面外弯曲振动峰，1 345 cm-1为—CH3伸缩振动峰。730 cm-1和1 345 cm-1分别为VOR和MTX的拉曼特征峰。

3.3 混合物中VOR和MTX的定性结果

利用小波空间中脊线、峰谷、零交叉点信息，通过设置脊线最大值阈值可以排除假峰，提升峰检测的准确度。混合药物的分析信号数据集包括VOR和MTX的信号、基线、随机噪声。因为小波是对称、零均值、变化缓慢、局部基线单调的函数，所以在“1.1”小波峰检测计算过程中会自动扣除局部缓慢变化的基线。FMWS可以认为是分析信号与尺度交换、平移后小波的卷积，因此可以压缩小波空间的噪声。利用小波提取到拉曼特征后，由VOR和MTX的SERS单一光谱进行定性匹配。混合药物的SERS光谱样本共有18组数据，即VOR浓度变化范围为0.1、0.01、0.001 mg/mL(即2.86×10-4、2.86×10-5、2.86×10-6mol/L)，MTX为1.0×10-3～1.0×10-8mol/L。分别以VOR和MTX的SERS光谱进行匹配计算，即可分别得到VOR(表1)和MTX(表2)的定性结果。FMWS相比于HQI方法，选取目标物的峰位置信息进行匹配，可自动忽略、排除其他杂峰等因素的干扰，即公式(4)计算出的FMWS值理论上明显高于HQI值。即采用小波空间特征匹配算法，可计算出混合物与标准品的SERS光谱匹配度。结果表明，混合物中的VOR和MTX的特征匹配系数值均大于0.96，且大部分的结果达到0.99，各组对应数值均大于HQI值。说明小波空间特征匹配方法可成功检出混合物的组分，且其准确性高于传统命中质量系数法。

3.4 混合物中VOR和MTX的半定量结果

由于重叠峰、密集峰、基线以及噪音等干扰因素，利用单个特征峰难以准确定量混合物中的组分含量。本研究依据VOR和MTX参考光谱数据，充分利用未知混合光谱全谱信息，采用非负最小二乘方法进行分析。即分别提取出VOR和MTX对应的730 cm-1和1 345 cm-1拉曼特征峰位置、峰强信息。对18组混合物的SERS光谱进行半定量分析。混合物光谱y，矩阵X一列是一个候选化合物VOR的光谱，一列是候选化合物MTX的光谱，b为候选化合物比例的向量。通过非负最小二乘可以计算出两者在混合物中的比例，并将其与真实占比进行对比(表3)。结果表明，混合物的各组分含量比可以进行定量，预测值与真实值之间相关性大于0.98。说明小波空间特征匹配结合非负最小二乘方法可实现对未知混合物中VOR和MTX组分的半定量分析。

表1 小波空间特征匹配系数与命中质量系数对不同浓度VOR的定性结果Table 1 FMWS and HQI of VOR with different concentrations in mixture

表2 小波空间特征匹配系数与命中质量系数对不同浓度MTX的定性结果Table 2 FMWS and HQI of MTX with different concentrations in mixture

表3 小波空间特征匹配对混合物组分VOR和MTX的定量结果Table 3 Quantitative analysis results of VOR and MTX mixture by FMWS

4 结 论

本研究合成了AuNPS-PDDA纳米复合物，借助SERS的表面增强效应，成功地定性和半定量分析混合物中的组分甲氨蝶呤(MTX)和伏立康唑(VOR)。针对重叠峰、密集峰、弱峰、基线以及噪音等干扰因素导致组分无法检出与准确定量这一难题，将小波信息转换至小波空间中进行峰检测，确定混合物中的物质成分，然后利用全谱信息进行半定量分析。该算法可以准确确定出混合物中组分，能预测其组分含量比例。结果表明，SERS技术结合小波空间特征匹配以及非负最小二乘方法可实现MTX和VOR的定性和半定量分析。