方 灵，韦 航，黄 彪，刘文静，苏德森，吴妙鸿，傅建炜

(福建省农业科学院 农业质量标准与检测技术研究所，福建 福州 350003)

抗生素主要用于预防和治疗细菌性感染类疾病，促进畜禽健康生长，以提高养殖质量和效率。在奶牛养殖中，抗生素主要用于治疗乳牛乳腺炎、腹泻等疾病[1-2]。泌乳期乳牛若过量使用抗生素或休药期不足，可能导致牛奶中残留抗生素，并通过食物链对人体健康造成不良影响，如引起胃肠不适、过敏反应、肝功能损害等[3-6]。此外，滥用抗生素或长期摄入含抗生素食品可能会产生细菌耐药性[7-8]，对人类健康危害更加严重，同时，抗生素残留对环境中微生物群落也会产生影响，并通过食物链影响高级生物，破坏生态系统[9]。为保障食品安全，我国农业部第235号公告规定了动物源性食品中抗生素的最大残留限量(MRL)[10]，许多国家及组织也制定了抗生素最大残留限量，限量标准日益严格。因此，建立一种快速、简便、灵敏的食品中抗生素检测方法十分必要。

目前，抗生素的检测方法主要有微生物法、生物传感法[11-12]、酶联免疫法[13-14]、液相色谱法[15-17]、液相色谱-串联质谱法[18-21]等。但微生物法、生物传感法及酶联免疫法的特异性不高，灵敏度较差；液相色谱法存在检测抗生素种类有限、检出限高等缺点。超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)因分析效率高、灵敏度高等优势，成为抗生素残留分析的主流检测方法。王浩等[21]利用液相色谱-串联质谱在30 min内测定了牛奶中5类35种抗生素残留，李宁等[19]开发了牛奶中4类25种抗生素残留的检测方法。但已有方法存在操作繁琐、耗时较长、检测抗生素种类或数量相对较少，以及不适于样品快速筛查分析的不足。抗生素残留问题日渐突出，由此带来的潜在风险引起了社会公众广泛关注，为确保我国食品和环境安全，探索一种快速、高效、灵敏的多种类抗生素残留同时测定方法迫在眉睫。

本文以奶牛养殖业中常用的抗生素为研究对象，针对不同种类抗生素理化性质的差异，优化了提取溶剂和净化条件，考察了基质效应，建立了同时测定牛奶中5类(磺胺类、喹诺酮类、四环素类、氯霉素类、大环内酯类)38种抗生素残留的UPLC-MS/MS方法。本方法成功应用于实际牛奶样品中目标抗生素的测定，可为牛奶中多类别、多组分抗生素的快速筛查提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters Acquity UPLC H-Class Xevo TQ-S超高效液相色谱-串联质谱仪(美国Waters公司)；涡旋振荡器(德国IKA公司)；HGC-36A氮吹仪(天津恒奥有限公司)；KQ-500DE超声仪(昆山市超声仪器有限公司)；Anke TDL-5-A离心机(上海安亭科学仪器厂)；Milli-Q 超纯水器(美国Millipore公司)。

1.2 标准溶液的配制

准确称取各标准物质适量，分别用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成质量浓度均为1 mg/mL的单标储备液；量取各单标储备液0.1 mL至同一10 mL容量瓶中，以甲醇定容并混匀，配制成质量浓度为10 μg/mL的混合标准工作溶液，于-20 ℃下密闭保存。准确移取一定量的混合标准工作溶液，配制成系列空白样品基质匹配标准溶液，现用现配。

1.3 样品前处理

准确称取1.00 g牛奶样品至15 mL 聚丙烯离心管中，加入5 mL 0.5%(体积分数)甲酸乙腈溶液，涡旋振荡后超声10 min，以5 000 r/min 离心5 min，取上清液，待净化。

Oasis PRiME HLB固相萃取小柱经5 mL乙腈-水溶液(体积比1∶1)活化平衡后，上样，流速为1 mL/min，用5 mL乙腈-水溶液(1∶1)洗脱，收集流出液，在40 ℃下氮吹近干，用初始流动相溶解并定容至1 mL，过0.22 μm滤膜后，待UPLC-MS/MS分析。

1.4 液相色谱与质谱条件

色谱条件：Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm i.d.,1.8 μm)；流速：0.4 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：2 μL；流动相：A为0.1%(体积分数)甲酸水溶液，B为甲醇。梯度洗脱程序：0～0.20 min，95%A；0.20～2.50 min，95%～50%A；2.50～4.50 min，50%～5%A；4.50～4.51 min，5%～95%A；4.51～8.00 min，95%A。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)；待测磺胺类、喹诺酮类、四环素类、大环内酯类抗生素为正离子模式，毛细管电压：2.5 kV；氯霉素类抗生素为负离子模式，毛细管电压：-2.5 kV；多反应监测模式(MRM)检测；离子源温度：150 ℃；脱溶剂温度：600 ℃；脱溶剂气和锥孔气均为氮气，流速分别为1 000、150 L/h；碰撞气为氩气(纯度> 99.999%)，流速为0.15 mL/min。其他质谱参数见表1。

2 结果与讨论

2.1 色谱与质谱条件的优化

5类抗生素在不同离子模式下的响应不同，磺胺类、喹诺酮类、四环素类、大环内酯类抗生素在正离子模式下响应较强，而氯霉素类在负离子模式下响应较强。因此，本研究选择正、负离子模式同时监测以提高效率。

考察了Acquity UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm i.d.,1.8 μm)和Acquity UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm i.d.,1.7 μm)对38种抗生素的分离效果。结果显示，经Acquity UPLC HSS T3色谱柱分离后38种抗生素的峰形相对更佳，这是由于HSS T3柱为硅胶基质色谱柱，适用于较宽极性范围的物质分析，对于同时分析多种目标物的效果相对较佳。

通过质谱扫描分析，分别对各抗生素进行正离子、负离子扫描，确定各目标物的分子离子，再对分子离子进行二级质谱扫描(子离子扫描)，对锥孔电压、碰撞能量等参数进行优化，选择响应强度较高的子离子为特征离子。设定驻留时间及采集通道，确保色谱峰采集点数在12点以上，以得到准确的定量结果。各抗生素的母离子、子离子、锥孔电压、碰撞能量见表1。

(续表1)

ClassCompoundRetentiontime(min)Precursorion(m/z)Production(m/z)Conevoltage(V)Collisionenergy(eV)Sparfloxacin(SPA,司帕沙星)3.72393.3292.1/349.3∗3724/20Orbifloxacin(ORB,奥比沙星)3.47396.1295.1∗/352.14022/14Difloxacin(DIF,双氟沙星)3.43400.2282.2∗/356.13727/21Oxolinicacid(OXO,喹酸)4.14262.0216.0∗/244.03030/19Flumequine(FLU,氟甲喹)4.45262.1202.0/244.0∗3535/15TetracyclinesDoxycycline(DXC,强力霉素)4.08445.2154.0/428.2∗3020/28Tetracycline(TC,四环素)3.28444.7410.2∗/427.33018/14Oxytetracycline(OTC,土霉素)3.33460.7426.2∗/444.23418/18Chlortetracycline(CTC,金霉素)3.82479.3444.2∗/462.23020/18ChloramphenicolsChloramphenicol(CAP,氯霉素)4.03320.9152.2∗/257.2588/16Thiamphenicol(TAP,甲砜霉素)3.14354.1184.9∗/226.96018/12Florfenicol(FFC,氟苯尼考)3.60356.2185.1/336.0∗5816/8MacrolidesErythrocin(ERY,红霉素)4.33734.5158.1∗/576.53032/20Roxithromycin(ROX,罗红霉素)4.47937.6158.1∗/679.54035/20

*quantitative ion

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 提取溶剂的优化抗生素残留分析的常用提取溶剂为乙腈、乙腈-水溶液、酸化乙腈等[22-23]。乙腈为中等极性溶剂，与多数抗生素的极性接近，且能使蛋白质变性沉淀。分别考察了乙腈、0.1%甲酸乙腈、0.2%甲酸乙腈、0.5%甲酸乙腈、1.0%甲酸乙腈5种提取溶剂对目标抗生素的提取效率。在空白牛奶样品中添加38种抗生素混合标准溶液，按照相同方法分析处理，进行加标回收试验。结果显示，采用0.5%甲酸乙腈提取时，38种抗生素的平均回收率相对较高，回收率为76.1%～ 91.0%。因此选择0.5%甲酸乙腈为提取溶剂。

图1 不同净化方法对38种抗生素回收率的影响Fig.1 Effect of different purification method on recoveries of 38 antibiotics

2.2.2 净化方法的优化牛奶中富含的蛋白质及脂肪不仅会干扰目标物的分析，也会影响色谱柱寿命，因此需对样品进行净化处理。分别比较了Oasis PRiME HLB、C18固相萃取小柱和QuEChERS试剂管对目标抗生素的净化效果(见图1)。结果表明，经Oasis PRiME HLB柱净化后，大部分目标化合物的回收率高于C18柱和QuEChERS试剂管。这可能是由于Oasis PRiME HLB柱中亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮聚合成的固相填料可以很好地吸附脂质，净化效果相对较好，因此选择Oasis PRiME HLB柱净化样品。

2.3 基质效应

基质效应(Matrix effect，ME)是基质中除目标物以外的其他成分对目标物分析的影响。由于其他成分与目标组分在离子化过程中存在竞争，改变了目标物的电离效率，使目标物的离子响应强度降低或增强，从而影响分析结果的准确性。通过考察空白样品基质中标准溶液的信号强度(A)与纯溶剂中相同浓度标准溶液信号强度(B)的比值来评价本方法的基质效应，即ME=A/B×100%。结果显示，大部分目标抗生素存在不同程度的基质效应，其中诺氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、洛美沙星、丹诺沙星、沙拉沙星以及4种四环素类抗生素存在较强的基质增强效应，少部分抗生素存在轻微的基质抑制效应。为降低基质效应影响，提高检测结果的准确性，本研究采用空白样品基质匹配标准溶液建立标准曲线，对基质效应进行校正。

图2 空白牛奶样品中38种抗生素的总离子流图(定量下限加标水平)Fig.2 Total ion chromatogram of 38 antibiotics in a blank milk sample(spiked with LOQ level)

2.4 线性范围与定量下限

根据每种抗生素的响应值，配制系列质量浓度的空白样品基质匹配标准溶液，在最佳条件下进行测定，以目标物定量离子的峰面积(Y)为纵坐标，对应质量浓度为横坐标(X)绘制标准曲线，外标法定量。以定量离子10倍信噪比(S/N=10)得到定量下限(LOQ)，方法的线性范围、LOQ结果见表2。结果显示，38种目标抗生素在各自线性范围内呈良好的线性关系，相关系数(r2)均大于0.99，LOQ为0.10～1.0 μg/kg。

2.5 回收率及相对标准偏差

在空白牛奶基质中分别添加1.0、5.0、10.0 μg/kg 3个水平的混合标准溶液，按照相同方法处理后进行UPLC-MS/MS测定，每个水平重复测定6次，计算回收率及相对标准偏差(RSD)。由表2可知，在3个加标水平下，38种目标抗生素的平均回收率为70.7%～ 94.9%，RSD为4.0%～ 9.4%。在LOQ加标水平下，空白牛奶基质中添加目标化合物后的总离子流色谱图见图2。结果表明，该方法能满足牛奶中38种抗生素残留的日常检测要求。

表2 38种抗生素的线性范围、定量下限、加标回收率及相对标准偏差(n=6)Table 2 Linear ranges,LOQs,recoveries and relative standard deviations of 38 antibiotics(n=6)

2.6 实际样品分析

表3 牛奶样品中抗生素的含量(n=3)Table 3 Contents of antibiotics in milk samples(n=3) w/(μg·kg-1)

*average value±standard deviation；**not detected

3 结 论

本研究建立了UPLC-MS/MS同时测定牛奶中5类(磺胺类、喹诺酮类、四环素类、氯霉素类和大环内酯类)38种抗生素残留的分析方法，对提取溶剂、净化方式等因素进行了优化。在最佳条件下，38种抗生素在各自线性范围内具有良好的线性关系，LOQ为0.10～1.0 μg/kg，在低、中、高3个加标水平下的平均回收率为70.7%～ 94.9%，RSD为4.0%～9.4%，各指标均满足分析检测的要求。该方法对于牛奶中多类别、多组分抗生素残留的分析监测、快速筛查具有参考意义。