廖 贤，袁剑英，牟 兰 ，曾 晞

(贵州省大环化学及超分子化学重点实验室,贵州大学 化学与化工学院，贵州 贵阳 550025)

汞及其化合物广泛应用于化工、照明、医疗器械等领域。汞又是最具毒性的金属之一，人体内积累的汞可导致认知损伤、运动障碍、失明、胚胎发育异常等，严重时将致人死亡[1-2]。人类活动产生的汞易随空气及水体迁移扩散，不仅可长时间稳定存在，而且会随着食物链不断循环累积，因此汞污染对环境有着深远的影响[3-4]。银是贵金属元素之一，含银化合物被广泛用于感光胶片洗印、金属冶炼加工和电镀等行业[5-7]。然而即使低浓度的银也对水生生物有着巨大危害，不仅会导致鱼类死亡，且当其经由水体进入人体时，还会沉着于各个器官中，进而影响视力、引发癫痫等[8]。因此环境中的痕量汞及银的检测对于保护人类健康以及自然环境有重要意义。

目前检测Hg2+及Ag+的方法有原子吸收光谱法[9-10]、原子发射光谱法[11]等，但存在样品预处理步骤繁琐或仪器昂贵等不足。荧光探针因具有灵敏性高、选择性好、响应时间短、便于实时监测等优点而备受关注[12]。但是目前大多数荧光探针受溶解性限制，不能在纯水介质中识别检测Hg2+及Ag+[13-15]，极大影响了这些探针在实际中的应用。故迫切需要构建一种可以在纯水介质中识别Hg2+及Ag+的新型荧光探针。

1,10-菲啰啉是一类含氮杂环化合物，其光电性质出色且易于修饰[16]，是研究最早和应用最广的含氮杂环化合物之一[17]。菲啰啉类荧光探针被广泛报道，如Li等[18]通过模拟绿色荧光蛋白设计得到了一种包含菲啰啉基团的化合物，该化合物对Zn2+具有选择性荧光增强的结合行为，此识别过程可应用于细胞成像；李俊等[15]在菲啰啉上引入两个水杨醛基团，成功获得了一类能选择性识别Cu2+和Ag2+的受体分子;Algi等[19]也基于菲啰啉结构骨架设计合成了在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)与水的混合溶剂中对Zn2+、Cd2+、Ni2+、Cu2+具有识别功能的荧光探针；Alreja等[20]报道了一种菲啰啉衍生物，其对Cu2+表现出良好的选择性。但已报道的菲啰啉类荧光探针存在水溶性较差及选择性不佳等问题，本文用1-溴乙酸对中间体a进行修饰，使探针的极性和水溶性得到增强,从而获得了可在纯水介质中检测Hg2+和Ag+的水溶性探针1，其合成路线见图1。

图1 探针1 的合成路线Fig.1 Scheme synthesis of probe 1

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

WNMR-I 500 MHz核磁共振仪(中国科学院武汉物理与数学研究所)；Nano ITC等温滴定量热仪(美国TA仪器公司)；Cary Eclipse荧光分光光度计(美国瓦里安公司)；Q Exactive 高分辨质谱仪( 美国赛默飞世尔科技公司)；Vertex 70 FT-IR红外光谱仪(布鲁克光谱仪器公司)。

2,9-二甲基-1,10-菲罗啉、吡啶-3-甲醛、酸酐、溴乙酸等购于上海晶纯化学试剂公司，金属高氯酸盐购于Aldrich and AlfaAesar化学试剂公司。所有药品均为分析纯，实验用水为超纯水。

1.2 探针1的合成

中间体a的合成：在50 mL三口瓶中，加入2,9-二甲基-1,10-菲罗啉(500 mg，2.4 mmol)、吡啶-3-甲醛(520 mg，4.8 mmol)、乙酸酐20 mL，N2保护下回流4 h，反应结束后减压蒸去溶剂，柱层析(V乙酸乙酯∶V正己烷=2∶8)纯化，得350 mg黄色固体a，产率37.7%;1H NMR(500 MHz,CDCl3,ppm)δ:8.90(s,2H),8.58-8.57(d,J=5 Hz,2H),8.29-8.27(d,J=10 Hz,2H),8.05-8.04(d,J=5 Hz,2H),7.96-7.95(d,J=5 Hz,2H),7.84-7.74(m,6H),7.40-7.37(m,2H)。

探针1的合成：在100 mL三口瓶中，加入中间体a(250 mg，0.64 mmol)、溴乙酸(520 mg，3.11 mmol)、乙腈50 mL，N2保护下回流24 h，反应结束后有黑色沉淀析出，过滤得到产物，滤液减压除去溶剂，用丙酮重结晶，两次共得390 mg探针1，产率91.7%;1H NMR(500 MHz,D2O,ppm)δ:8.97(s,2H),8.69-8.68(d,J=5 Hz,2H),8.59-8.57(d,J=10 Hz,2H),8.19-8.17(d,J=10 Hz,2H),7.91-7.90(t,J=5 Hz,2H),7.62(s,4H),7.54-7.51(d,J=15 Hz,2H),7.39-7.36(d,J=15 Hz,2H),5.36(s,4H);IR(KBr，cm-1)σ：3 421,2 059,1 634,1 537,1 379,1 158,1 088,968,874,815,710,675,613,521;MS(ESI)m/z:665.077[M+H]+。

1.3 溶液配制

用水溶解探针1，配制成浓度为0.1 mmol/L 的储备液。金属离子的高氯酸盐均用水溶解，配制成浓度为20 mmol/L 的储备液。

1.4 光谱测量

在10 mL容量瓶中分别加入探针1储备液(0.1 mmol/L,1.0 mL)和金属离子储备液，并用水溶液稀释至刻度，摇匀，测定荧光光谱。激发波长为350 nm，狭缝为5 nm。

1.5 1H NMR滴定

于一系列核磁管中分别加入500 μL 1 mmol/L的探针1，再分别加入0、0.5、1.0 mmol/L的高氯酸汞，或0、0.25、0.5、1.0 mmol/L的高氯酸银。溶剂为DMSO-D6，25 ℃下测定核磁共振氢谱(500 MHz)。

1.6 等温量热滴定

于样品池内加入探针1溶液(0.1 mmol/L,1.0 mL)，温度设定为18 ℃，将Hg2+或Ag+的水溶液(2 mmol/L)吸入100 μL的滴定注射器中，设定搅拌速率为250 r/min，连续滴定，一滴体积为4 μL，每滴间隔250 s，共滴25次。参比池内注入水作为样品池的热平衡参照，并进行空白实验以避免稀释热的影响。使用该仪器上搭载的Launch Nano Analyze软件进行数据采集分析。以非线性最小方差拟合，计算相关参数。

图2 探针1(10 μmol/L，H2O)与不同金属离子(0.2 mmol/L)作用的荧光光谱Fig.2 Fluorescence spectra of probe 1(10 μmol/L,H2O) with different metal ions(0.2 mmol/L)λex/λem=350 nm/475 nm;other metals:Mg2+,Li+,Na+,Ca2+,K+,Ba2+,Zn2+,Cu2+,Sr2+,La3+,Co2+,Ni2+,Pb2+,Cd2+,Al3+,Cr3+,Fe3+

2 结果与讨论

2.1 探针1对Hg2+、Ag+离子的识别

为了考察探针1对金属离子的识别性能，测定了探针1水溶液(10 μmol/L)中分别加入不同金属离子后的荧光光谱(图2)。探针1溶液在475 nm处有很强的荧光发射，分别加入0.2 mmol/L的Hg2+或Ag+后荧光猝灭。而在同样条件下，向探针1溶液中分别加入0.2 mmol/L的Mg2+、Li+、Na+、Ca2+、K+、Ba2+、Zn2+、Cu2+、Sr2+、La3+、Co2+、Ni2+、Pb2+、Cd2+、Al3+、Cr3+、Fe3+,却几乎不能使探针1的荧光光谱发生任何变化。这表明探针1可以选择性识别Hg2+及Ag+。

为了研究其它金属离子对探针1选择性识别过程的影响，向存在0.2 mmol/L Hg+或Ag2+的探针1水溶液(10 μmol/L)中分别加入0.2 mmol/L的Mg2+、Li+、Na+、Ca2+、K+、Ba2+、Zn2+、Cu2+、Sr2+、La3+、Co2+、Ni2+、Pb2+、Cd2+、Al3+、Cr3+、Fe3+后测量475 nm处荧光强度(图3)，结果表明探针1对Hg2+、Ag+的识别基本不受上述其它金属离子的影响。

图3 共存金属离子对探针1识别Hg2+(A)、Ag+(B)的影响Fig.3 Fluorescence response of probe 1(10 μmol/L，H2O) and different coexisting ions of Hg2+(A) or Ag+(B)black bars:emission intensity of probe 1 on addition of the respective metal ions(0.2 mmol/L)；white bars:emission intensity of probe 1 on addition of the respective competing ions(0.2 mmol/L) and Hg2+ or Ag+(0.2 mmol/L)；λex/λem=350 nm/475 nm

2.2 荧光光谱滴定

考察了探针1对Hg2+、Ag+的信号响应情况。向探针1(10 μmol/L，H2O)溶液中分别加入不同浓度的Hg2+或Ag+，发现随着体系中Hg2+或Ag+浓度的增加，475 nm处的荧光强度逐渐降低。推测Hg2+或Ag+与探针1配位时发生了反向光致电子转移(Reverse PET)过程，导致荧光猝灭。在加入大约10 μmol/L的Hg2+后光谱趋于稳定，表明探针1与 Hg2+可能以1∶1的方式配位结合(图4A，内插下图)。然而加入大约5 μmol/L的Ag+后光谱趋于稳定，表明探针1与Ag+可能是以2∶1方式配位结合的(图4B，内插下图)。通过等摩尔连续变化法(Job's-Plot)(图4，内插图上图)也得到探针1与Hg2+及Ag+的结合比分别为1∶1和2∶1，与滴定实验得到的结果一致。

2.3 比色法检测Hg2+及Ag+

利用探针可对Hg2+和Ag+的荧光猝灭识别性能进行快速简便的比色检测。于365 nm紫外灯下，向探针1(10 μmol/L，H2O)中分别加入 0、5、10、15 μmol/L的 Hg2+，或分别加入 0、2.5、5、10 μmol/L 的 Ag+，通过肉眼观察发现，随着离子浓度的增大，探针溶液明亮的蓝色荧光逐渐减弱，直至消失(图5)。这表明探针1能通过目视比色法定性和半定量检测 Hg2+和Ag+。由于当Hg2+、Ag+的浓度别为5、2.5 μmol/L时荧光强度出现了下降，故该法对Hg2+、Ag+检出限分别为5、2.5 μmol/L。

2.4 探针1检测Hg2+及Ag+的分析参数与热力学参数

线性范围和检出限是探针定量检测的重要指标[21]。如图4所示，随着体系中Hg2+或Ag+浓度的增加，475 nm处的荧光强度逐渐降低。结果显示探针1检测Hg2+的线性范围为9.0×10-7～1.1×10-5mol/L，以Hg2+浓度为x轴，荧光强度为y轴进行线性拟合，得到校正曲线方程为y=-635.9x+677.7(r2=0.995 3，n=11)；同样得到检测Ag+的线性范围为8.0×10-7～7.0×10-6mol/L，校正曲线方程为y=-605.1x+653.0(r2=0.991 9，n=7)。利用检出限公式(LOD=3σ/s，式中σ为测定10次空白值的标准偏差，s为校正曲线的斜率)得到探针1检测Hg2+和Ag+的检出限为分别为1.06×10-8、1.11×10-8mol/L。我国饮用水对Hg2+、Ag+的限量要求分别为0.5×10-8、5.0×10-7mol /L[22]，探针1对Hg2+的检出限略高于此值，而对Ag+的检出限低于限量要求。我国污水综合排放对Hg2+、Ag+的限量要求依次为2.0×10-7、5.0×10-6mol/L[23]，探针1检测该两种离子的检出限可满足该要求。本文构建的探针与其它报道相比，具有检出限低和能在纯水介质中检测的优点(表1)。

等温量热滴定实验显示，探针1与Hg2+和Ag+的作用均为吸热过程，作用的Ka值依次为6.02×105、1.04×106M-1，计算得出探针1与上述两种离子的摩尔结合自由能ΔG°(ΔH°-TΔS)分别为-29.93、-33.52 kJ/mol，表明识别过程自发进行。

表1 本文工作与其它报道比较Table 1 Comparison of this work with other literature examples

2.5 探针1检测Hg2+及Ag+的作用机理

通过核磁滴定实验考察了探针1分子识别Hg2+和Ag+的作用机理。因探针1在水中溶解的最大浓度达不到该项实验要求，故选择在 DMSO-D6溶剂条件下进行实验。从探针1(1 mmol/L)与Ag+的1H NMR滴定谱图(图6)中观察到，随着Ag+的加入，位于吡啶基团上的H9质子峰明显向高场位移(Δδ=-0.09 ppm)，而位于菲啰啉基团上的H2质子峰却向低场位移(Δδ=0.04 ppm)，这可能是由于羰基氧原子上的孤对电子被Ag+所吸引从而使吡啶基团的电负性增强，而这种电负性变化通过共轭体系传导进而使菲啰啉基团上的电子云密度减小。由此说明探针1上的羰基氧原子为Ag+提供了作用位点(图7)，该过程引发了反向光致电子转移(Reverse PET)，使共轭体系上的电子以非辐射跃迁的方式回到基态，致使探针分子的荧光发生猝灭。探针1(1 mmol/L)与Hg2+的1H NMR滴定谱图也观察到类似的现象，说明Hg2+也与羰基氧原子配位(图7)，引发了Reverse PET过程，不同的是Ag+与两个探针分子结合而Hg2+只与一个探针分子结合。

图6 探针1(1 mmol/L)随着Ag+浓度增加的局部 1H NMR图( DMSO-D6，298 K)Fig.6 Partial 1H NMR spectra of probe 1 with the increase of Ag+ concentrations( DMSO-D6，298 K)

图7 探针1对Ag+和Hg2+识别机理猜想Fig.7 Plausible recognition mechanism of the probe 1 towards Ag+ and Hg2+

3 结 论

设计合成了一种新型水溶性菲啰啉荧光探针，并对其性质进行考察。在纯水介质中，探针1通过荧光猝灭方式识别Hg2+和Ag+，结合比分别为1∶1和2∶1，检测的线性范围依次为9.0×10-7～1.1×10-5、8.0×10-7～7.0×10-6mol/L，检出限均低至10-8mol/L。利用探针1与Hg2+和Ag+的作用模式不同可以对其进行区分。根据识别前后的荧光强度变化，建立了裸眼快速检测Hg2+和Ag+的可视化分析方法。等温量热滴定实验显示，探针1与Hg2+和Ag+作用的Ka值分别为6.02×105、1.04×106M-1。通过1H NMR滴定探讨了探针1检测Hg2+和Ag+的作用机理，发现离子与探针分子的羰基氧原子配位，引发了Reverse PET过程。该研究为探针1在生物体及环境领域中的潜在应用提供了参考依据。