离子液体修饰的磁性类沸石咪唑酯骨架材料在藻毒素分析中的应用

2019-06-21吴怡秋高仕谦李小蒙张占恩

分析测试学报 2019年6期

吴怡秋，高仕谦，李小蒙，张占恩,2*

(1.苏州科技大学环境科学与工程学院，江苏苏州 215000；2.苏州科技大学江苏省水处理技术与材料协同创新中心，江苏苏州 215000)

近年来，世界各地蓝藻暴发频率迅速增加，已成为国内外普遍关注的环境问题[1]。微囊藻毒素(Microcystins，MCs)是由蓝藻和绿藻水华产生的一类具有环七肽结构的致癌毒素，长期摄入会引起肝细胞肿胀、坏死，甚至会发展成肝癌[2-3]。在已鉴定的80余种不同结构MCs中，MC-RR和MC-LR是最常见的两种类型[4]。由于MCs的中毒事件时有发生，世界卫生组织(WHO)及我国《饮用水水质标准》均将生活饮用水中MC-LR的浓度上限定为1 μg/L[5-6]。由于水体中MCs的浓度通常较低，常用的前处理方法有固相萃取(SPE)[7-8]、在线固相萃取(Online-SPE)[9]及磁性固相萃取(MSPE)[10]，其中MSPE由于操作简便、萃取时间短以及洗脱溶剂用量少等优点而得到广泛使用[11-12]。目前测定MCs的方法主要有酶联免疫分析法(ELISA)[13]、高效液相色谱法(HPLC)[14]以及液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[15-16]，其中液相色谱-串联质谱法因具有较高的选择性及灵敏度等特点，已广泛应用于MCs的测定。

离子液体(Ionic liquid，IL)是一类新型绿色溶剂，具有溶解能力强、热稳定性好、不挥发等特点，对各种有机化合物及金属离子均有良好的萃取性能[17]。ZIF-8作为金属有机骨架材料 (Metal organic frameworks,MOFs)的一个重要分支，是一种优良的吸附材料，具有合成简便、热稳定性好以及比表面积高等优点。本文通过在磁性M/ZIF-8纳米微球表面负载离子液体进行功能化修饰，制备了IL@M/ZIF-8磁性纳米材料。在与离子液体的结合过程中，M/ZIF-8的晶体结构可基本保持不变，而IL@M/ZIF-8兼具与微囊藻毒素的氨基和羧基形成静电相互作用位点的咪唑基。本文将该种具有特异选择性和较强富集能力的磁性材料作为固相萃取吸附剂用于富集水样中的MCs，并结合UPLC-MS/MS进行定性定量分析，建立了一种操作简便、绿色环保、选择性好、灵敏度高的检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Ultimate 3000高效液相色谱仪 (美国Dionex公司)、TSQ Quantum Ultra EMR 三重四极杆质谱检测器(美国Thermo公司)；Nicolet-6700傅立叶转换红外光谱分析仪(美国Thermo公司)；DC-12型氮吹仪(上海安普公司)；DZF-6090型真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；KQ-300VDE型三频数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；JJ-1精密增力电动搅拌器(金坛市科析仪器有限公司)。

MC-LR、MC-RR标准溶液(纯度大于95%，美国Standford Chemicals公司)；甲醇、乙腈(色谱纯，美国Tedia公司)；甲酸(色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；溴代1-丁基-3-甲基咪唑 ([Bmim]Br,上海成捷化学有限公司)；异丙醇、无水乙醇、FeCl3·6H2O、Zn(NO3)2·6H2O、2-甲基咪唑、氨水、NaCl、丙酮、乙二醇、无水醋酸钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；实验用水为美国Millipore公司Milli-Q纯水系统制备的超纯水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 混合标准溶液的配制

MC-LR和MC-RR的原液浓度为100.0 mg/L，精确移取一定体积,甲醇溶解定容后配制成50 mg/L的混合储备液，移取200 μL 50 mg/L的储备液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容后配制成1 mg/L的混合标准溶液，密封储存于4 ℃冰箱中。使用前稀释成一系列浓度的标准溶液。

1.3 色谱-质谱条件

1.3.1 色谱条件色谱柱：Zoxbax Eclipse XDB-C18反相色谱柱 (50 mm×3 mm，1.8 μm，美国Agilent公司)；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；流速：0.4 mL/min；流动相：A为甲醇，B为1‰甲酸水溶液。梯度洗脱程序：0～3 min，5%～95%A；3～4.5 min，95%～100%A；4.5～5 min，100%A；5～8 min，100%～5%A。

1.3.2 质谱条件离子源：电喷雾电离源(ESI+)；扫描方式：多反应监测(MRM)；喷雾电压：3 500 V；鞘气压力：241 kPa；辅助气压力：103 kPa；碰撞气压力：0.2 Pa；质谱分析参数如表1所示。

表1 2种MCs的质谱分析参数及保留时间Table 1 MS/MS parameters and retention times of two MCs

*quantitative ion

1.4 磁性纳米材料的制备

1.4.1 Fe3O4磁性粒子的制备准确称取6.74 g FeCl3·6H2O分散在125 mL乙二醇中，搅拌均匀生成黄色透明溶液后加入14.37 g无水醋酸钠，继续搅拌至混合均匀，将上述混合溶液转至200 mL高压反应釜中，在200 ℃下反应8 h。得到的Fe3O4于60 ℃下真空干燥8 h，研磨备用。

1.4.2 Fe3O4@ZIF-8磁性复合微球的制备将1.8 g Fe3O4加至100 mL 0.3%的聚苯乙烯磺酸钠水溶液中超声15 min，收集后用水洗涤3次，然后将其加入含有140 mL甲醇、4.93 g 2-甲基咪唑和2.23 g Zn(NO3)2·6H2O的混合溶液中，在45 ℃下搅拌3 h。收集并洗涤后于60 ℃下真空干燥12 h，研磨备用。

1.4.3 IL@M/ZIF-8磁性纳米粒子的制备将0.5g [Bmim]Br加至50 mL丙酮中超声至完全溶解，加入2 g M/ZIF-8，在30 ℃下搅拌至丙酮完全挥发，洗涤至近中性后于105 ℃下真空干燥12 h，研磨备用。

1.5 样品前处理方法

准确称取50 mg IL@M/ZIF-8于100 mL水样中振荡15 min，用铁铷硼磁铁收集磁性纳米粒子，弃去上清液。用1.5 mL乙腈-0.1%甲酸水溶液(3∶1)涡旋洗脱1 min，重复洗脱2次后收集洗脱液。将洗脱液用N2吹干，用1 mL初始流动相复溶，经0.22 μm有机滤膜过滤后，UPLC-MS/MS分析。

2 结果与讨论

2.1 材料的表征

通过扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)对所合成材料的表面形态进行表征。图1A为水热法合成的Fe3O4磁性粒子的SEM图，其呈现规则的球形，表面粗糙，粒径在400 nm左右。图1B、C分别为IL@M/ZIF-8的SEM和TEM图，IL@M/ZIF-8材料的核心为黑色的Fe3O4球体，外层包裹了IL和ZIF-8。IL@M/ZIF-8材料表面有大量褶皱，从而增大了比表面积，提供了更多吸附位点。

图1 Fe3O4的扫描电镜图(A)及IL@M/ZIF-8的扫描电镜(B)、透射电镜图(C)Fig.1 SEM image of Fe3O4(A),SEM(B) and TEM(C) images of IL@M/ZIF-8

图2 Fe3O4、Fe3O4@ZIF-8、IL@M/ZIF-8及IL的红外光谱图Fig.2 FT-IR spectra of Fe3O4,Fe3O4@ZIF-8,IL@M/ZIF-8 and IL

进一步采用傅立叶红外光谱(FT-IR)对材料表面的分子结构进行表征。如图2所示，580 cm-1处的特征峰为Fe3O4的Fe—O—Fe弯曲振动吸收峰；1 088 cm-1处的特征峰为IL的C—Br伸缩振动峰；1 167 cm-1处为咪唑环的伸缩振动峰；1 339 cm-1附近为甲基C—H的变形振动峰；1 421 cm-1和1 584 cm-1附近为咪唑环的骨架振动峰；2 930 cm-1处为咪唑环上的C—H伸缩振动峰。红外谱图显示，咪唑基团同时存在于IL和ZIF-8上，该基团可与微囊藻毒素的氨基和羧基之间通过静电吸引力而相互结合，从而达到富集的目的。

图3 溶液pH值(A)和IL@M/ZIF-8用量(B)对吸附效率的影响Fig.3 Effect of solution pH value(A)and IL@M/ZIF-8 amount(B)on adsorption efficiency

2.2 样品前处理条件的优化

2.2.1 水样pH值的选择水样的pH值会影响目标物的化学性质和吸附剂表面电荷的密度和类型，因此选择合适的pH值十分重要。考察了不同pH值(1.0～8.0)对目标物回收率的影响(图3A)，结果表明，随着pH值的增大，MC-RR和MC-LR的回收率逐渐增大，当pH 4.0时，2种MCs的回收率达到最大值(约78%)，此时MCs和吸附剂间的静电吸引力最大；随着pH值的继续增大，回收率逐渐降低。因此选择水样的最佳pH值为4.0。

2.2.2 IL@M/ZIF-8用量的选择称取不同质量(30、40、50、60、70、80 mg)的IL@M/ZIF-8加入100 mL 1 μg/L 的MCs溶液中，考察了吸附剂用量对回收率的影响。如图3B所示，当IL@M/ZIF-8投加量在30～50 mg之间时，随着投加量的增加，回收率显著提高；当投加量达到50 mg时，回收率接近90%；继续增加投加量至80 mg，回收率反而有所下降。因此实验选择50 mg作为IL@M/ZIF-8的最佳用量。

2.2.3 萃取时间的选择萃取时间是磁性固相萃取技术中的重要参数之一，要在保证较高萃取效率的前提下尽量缩短萃取时间。分别考察了不同振荡时间 (3、5、10、15、20、30 min)下的萃取效率，当振荡时间小于5 min时，材料对MC-RR和MC-LR的萃取效率较低；之后随着振荡时间的增加而增加，当振荡时间达到15 min时，回收率达到最大值，此时藻毒素的吸附达到平衡；进一步延长振荡时间，MC-RR和MC-LR的回收率均变化不大。因此，实验选择15 min作为最佳萃取时间。

2.2.4 洗脱条件的选择洗脱溶剂的种类和用量均是影响MSPE萃取效率的重要因素。考察了4种单相洗脱溶剂(甲醇、丙酮、乙腈和异丙醇)对MC-RR和MC-LR的洗脱效果，实验结果并不理想。由于溶液的酸度也会影响藻毒素的洗脱效果，继而分别考察4种单相脱溶剂和甲酸混合而成两相洗脱溶剂时的洗脱效果，其中以乙腈-0.1%甲酸水溶液两相洗脱溶剂对藻毒素的洗脱效果最佳，进一步考察不同体积比(1∶3、1∶1、3∶1、9∶1)乙腈-0.1%甲酸水溶液的洗脱效果，结果显示体积比为3∶1的乙腈-0.1%甲酸水溶液效果最佳。

为了确定洗脱溶剂乙腈-0.1%甲酸水溶液 (3∶1)的用量，分别考察不同体积 (0.6、1.5、3.0、3.5、4.5、6.0 mL)洗脱溶剂的萃取效果。结果显示，在0.6～3.0 mL之间，随着洗脱溶剂体积的增加，萃取效率显著提高，当体积达到3.0 mL时，萃取效果达到最佳，之后继续增大洗脱溶剂体积，洗脱效果变化不明显。因此，综合考虑选择最佳洗脱溶剂体积为3.0 mL。

2.3 方法评价

2.3.1 线性关系、定量下限与检出限配制浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.5、1、5 μg/L的MCs标准溶液，在上述最优条件下进行样品前处理，并在确定的色谱-质谱条件下测定，以峰面积(Y)和质量浓度(X，μg/L)绘制标准工作曲线。结果显示，MC-RR在0.01～5 μg/L浓度范围内，MC-LR在0.05～5 μg/L浓度范围内呈良好线性，线性系数分别为0.999 5和0.999 3。MC-RR和MC-LR的检出限(S/N=3)分别为1.98 ng/L和3.94 ng/L，定量下限(S/N=10)分别为6.52 ng/L和12.98 ng/L。由于常规检测MCs的方法检出限为0.05～10 μg/L[18-21]，本方法的检出限比已有方法的最低值(0.05 μg/L)低1个数量级，具有更高的灵敏度。图4为质量浓度为1 μg/L的2种MCs标准溶液的色谱图。

2.3.2 回收率与精密度在空白水样中加入3个浓度水平 (0.1、1、5 μg/L)的MC-RR和MC-LR标准溶液，按最优MSPE方法进行处理，每个水平平行测定6次，计算回收率和相对标准偏差(RSD)。结果显示，空白水样中2种MCs的加标回收率为90.3%～98.2%，RSD为2.6%～6.3%，方法的精密度与准确度满足测定要求。

2.4 与IL@Fe3O4和ZIF-8@Fe3O4的对比

分别考察了IL@M/ZIF-8、IL@Fe3O4及ZIF-8@Fe3O4对0.2 μg/L MCs的回收率。结果显示，IL@M/ZIF-8对MC-LR和MC-RR的回收率分别为(90.8±4.3)%和(94.9±3.7)%，IL@Fe3O4的回收率分别为(83.6±2.9)%和(86.2±5.2)%，ZIF-8@Fe3O4的回收率分别为(87.4±3.2)%和(88.2±4.8)%。IL@Fe3O4和ZIF-8@Fe3O4的回收率虽能达到83%以上，但单种材料对Fe3O4的修饰效果有限，而复合修饰材料IL@M/ZIF-8可得到更高的回收率。此外，由于具有更大的比表面积和更多的吸附点位，IL@M/ZIF-8材料的用量(50 mg)以及达到吸附平衡的时间(15 min)比IL@Fe3O4(95 mg，35 min)和ZIF-8@Fe3O4(80 mg，25 min)大幅度减少，减少了材料用量并提高了萃取效率和分析性能。

2.5 方法的应用

采集太湖水域3个点位的水样，经0.45 μm滤膜过滤后，采用基于 IL@M/ZIF-8材料建立的方法对MC-LR和MC-RR进行萃取，用UPLC-MS/MS进行检测，每个水样平行测定6次，同时，对水样进行0.5 μg/L和2 μg/L两个浓度水平的加标回收率实验，每个浓度平行测定6次。结果如表2所示，在未加标情况下，1#点位未检测出MCs，2#和3#点位检出MC-RR的浓度分别为0.233 μg/L和0.172 μg/L；在加标情况下，3个点位检测浓度为0.442～2.418 μg/L，回收率达88.5%～108%，RSD为1.5%～7.2%，研究结果表明该方法具有实际可操作性，适用于环境水样中痕量MCs的测定。

表2 太湖水样中2种MCs在不同加标水平下的回收率(n=6)Table 2 Recoveries of two MCs from water samples in Taihu at different spiked levels(n=6)

*:no detected; **:no data

2.6 与其他方法的比较

为了评估本方法的萃取和分析性能，将其分析参数与已有方法进行对比。如表3所示，在同样检测方法 (HPLC-MS/MS)的前提下，与表中所列的几种预处理方法 (SBSE[19]，SPE[20]，Online-SPE[9]，MSPD[21])对MC-LR的萃取效率进行比较。结果显示，本方法得到的LOD (0.004 μg/L)最低，且远低于《饮用水水质标准》规定的检出限 (1 μg/L)[6]。此外，本方法的萃取和分析时间也均少于其他方法，在萃取和分析效率方面具有较大优势。