贾 玮，刘余阳，石 琳，许秀丽，储晓刚,

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院，陕西 西安 710021;2.中国检验检疫科学研究院，北京 100123)

葛根是豆科葛属野葛或粉葛的干燥根，具有降低血糖、血脂以及解酒、抗癌、护肝，兼有辛温、祛风寒的作用[1-5]，其主要活性成分为葛根素(Puerarin)、大豆苷元(Daidzein)、染料木苷(Genistin)等异黄酮类化合物[6-9]。其中，葛根素具有抗细胞凋亡作用，可减轻多种细胞的凋亡，包括神经元、小胶质细胞、成骨细胞和心肌细胞[10-14]。葛根具有良好的药用及保健价值，目前葛根产品的开发利用多为临床用药、保健食品以及饲料加工。

产品的多样性以及高需求量带来了针对其功效成分的高通量快速筛查方法需求[15]。近年来，针对葛根及其相关产品中葛根素和其他异黄酮类化合物的定性、定量方法有多种[16]，如采用高效液相色谱法测定药品中葛根素等4种异黄酮含量[17]，利用电化学方法检测葛根素[18]，采用酶联免疫吸附法快速评价葛根药材质量[19]，而非定向筛查方法应用于葛根保健品的相关研究未见报道。非定向筛查是在定向筛查建立数据库的基础上，通过数据挖掘来筛查定向目标物及其以外的化合物，并进行筛选确证[20-21]。质谱的扫描范围相对较宽，可实现对多种物质的筛选、定性与定量分析，为非定向筛查奠定了基础。目前，基于质谱的非定向筛查方法广泛应用于食品中污染物质、农兽药残留以及毒素的定性与定量分析。将非定向筛查方法应用于食品中危害物的判别，是我国“十三五”规划前沿关键技术之一。

本研究通过超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-Q-Orbitrap HRMS)对葛根保健品中已知功效成分的断裂机理以及碎裂片段特征进行研究，建立了一种非定向筛查方式，并采用Full MS/dd-MS2扫描模式建立相应的标准谱库，采用数据非依赖型采集模式(vDIA)对样品成分进行分析。该方法可为葛根保健品中未知功效成分的检测提供技术依据，同时还可应用于其他食品中未知成分的检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Dionex Ultimate 3000超高效液相色谱仪和UPLC-ESI-Orbitrap HRMS系统(美国Thermo-Fisher Scientific公司);高速冷冻离心机(美国Beckman Coulter公司);Milli-R04 纯水仪(德国Millipore公司)；KQ-500DE型超声波清洗器(昆山市超声波仪器有限公司)。甲醇(质谱纯，美国Fisher公司)；葛根固体饮料样品(陕西华健汉菖生物科技有限责任公司)。标准物质：3′-羟基葛根素、4′-O-甲基葛根素、葛根素-6″-O-木糖苷、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、黄豆黄苷、黄豆黄素、染料木苷、芒柄花苷、染料木素、芒柄花黄素、柚皮苷、柚皮素、橙皮素、橙皮苷(美国Sigma-Aldrich公司)。

1.2 溶液制备

1.2.1 标准溶液的配制分别准确称取各标准品0.001 g于10 mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容，配制成100 mg/L的标准储备液，经0.22 μm有机滤膜过滤后于4 ℃冰箱中保存备用。取15种标准储备液各5 μL，混匀后即得质量浓度为 100 mg/L的混合标准溶液。

1.2.2 样品的处理准确称取2.0 g(精确至0.01 g)葛根固体饮料粉末，加至10 mL 70%甲醇溶液中，超声振荡提取30 min后过滤纸，将沉淀物加至70%甲醇溶液中，再次超声振荡提取，过滤。合并两次提取液冷却至室温后，以10 000 r/min冷冻离心30 min，取上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤后，待进样分析。

1.3 色谱-质谱条件

色谱条件：色谱柱为Accucore aQ液相色谱柱(150 mm×2.1 mm，2.6 μm，美国Thermo-Fisher Scientific公司)；流速：0.3 mL/min；流动相：A为甲醇，B为水。梯度洗脱程序：0～3 min，0%～30% A；3～5 min，30% A；5～10 min，30%～70% A；10～12 min，70% A；12～12.1 min，70%～0% A；12.1～15 min，0% A。柱温：30 ℃，进样体积：5 μL。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正离子模式；全扫描模式(Full MS)以及数据非依赖型采集模式(Data independent acquisition,vDIA)；碰撞气体：N2；离子源温度：350 ℃；毛细管电压:3.5 kV；质量扫描范围:m/z50.0～750.0，鞘气流速:14.4 L/min，辅助气流速:30 L/min。

2 结果与讨论

2.1 功效成分标准谱库的建立

将100 mg/L混合标准溶液逐级稀释配制成500 μg/L标准溶液，用于标准谱库的建立。运用Full MS/dd-MS2扫描模式建立标准谱库，采集功效成分的分子离子的质荷比(理论值)、二级碎裂片段的质荷比与保留时间。所有功效成分标准谱库的信息均使用Exact Finder1.0软件(美国Thermo-Fisher Scientific公司)进行管理且在样品筛查时用于数据分析。

2.1.1 分子离子的主要离子化形式为确保色谱保留时间与分子离子在质谱中空间信息的准确性及重现性，每个功效成分进样6次，并使用Xcalibur软件选取与理论值偏差小且质量精度高的一级分子离子的准确离子化形式。电喷雾有正、负电离模式，如[M-HCOO]-、[M-H]-、[M+NH4]+、[M+Na]+、[M+H]+等，在本实验中产生的分子离子以[M+H]+为主。

2.1.2 二级断裂碎片的理论值利用密度泛函理论，并结合Mass Frontier 7.0软件(美国Thermo-Fisher Scientific公司)预测结果，对功效成分的裂解途径进行分析。筛选dd-MS2模式获取响应值高且有特征性的碎裂片段，基于元素构成阈值计算质谱裂解反应生成片段的理论值，建立化合物标准谱库(Library)。

2.1.3 标准谱库信息的管理葛根保健品中部分功效成分的标准谱库使用mzVault软件进行数据管理，可以进行化合物名称、CAS号、分子式、质荷比等的谱图检索。表1列出了15种功效成分的标准谱库信息。

表1 葛根保健品中15种功效成分的标准谱库信息Table 1 Standard library parameters of 15 functional components in food supplements of pueraria

*no data

2.2 片段断裂特征及其在物质筛查中的作用

2.2.1 断裂机理研究葛根保健品中的功效成分多为异黄酮与黄烷酮类化合物[9]。在ESI正离子模式下，异黄酮类化合物通常在母核的环状结构上发生质谱裂解。以3′-羟基葛根素为例，其分子离子峰为m/z433.112 92[M+H]+，质谱碎裂途径如图1所示。在图2所示的途径中，该化合物经γ-H重排转移电荷中心，在正离子模式下准分子离子峰m/z433.112 92[M+H]+脱去1分子C4H11O4形成碎片离子m/z311.055 01[M+H-C4H11O4]+，之后再脱去1分子CO得到碎片离子m/z283.060 10[M+H-C4H11O4-CO]+；或经i断裂与γ-H重排后脱去1分子C5H11O5得到碎片离子m/z283.060 10[M+H-C5H11O5]+。

2.2.2 片段断裂特征以黄烷酮类中的柚皮苷为例，其分子式为C27H32O14，是黄酮类化合物的衍生物，具有黄酮类化合物的母核2-苯基色原酮(C15H10O2)。通过对黄烷酮结构的研究，推测其片段断裂机理，发现橙皮苷、柚皮苷、橙皮素等化合物均有碎片C7H5O4(m/z153.081 24)，可知其为该类化合物共有的碎裂片段，可用于该类化合物的筛查。质谱裂解反应机理为电子转移规律，基本类型包括电荷中心的转移、游离基的转移、重排反应和简单键断裂(α、β、σ等断裂)。实验采用相同的碰撞能，将化合物的分子离子与高纯度氮气碰撞，得到稳定的二级谱图，碎片信息较完善，随后可通过分子离子质荷比、碎片离子质荷比等已有的信息找出特征碎裂片段。通过对已有标准品碎裂片段断裂机理的研究，并结合该化合物的结构，推断出功效成分的特征碎裂片段，用于未知化合物的筛查。表2列出了异黄酮类与黄烷酮类化合物的特征碎裂片段。

图1 3′-羟基葛根素可能的裂解途径Fig.1 Proposed fragmentation pathway of 3′-hydroxy puerarin

CategoryFormulaofcharacteristicfragmentStructuralformulaTheoreticalmass-to-chargeratio(m/z)Isoflavones(异黄酮类)C20H15O6351.08631C16H13O4269.08084

(续表2)

CategoryFormulaofcharacteristicfragmentStructuralformulaTheoreticalmass-to-chargeratio(m/z)Flavanones(黄烷酮类)C7H5O3137.02332C16H15O6303.08631

2.2.3 特征断裂片段在功效成分筛查中的应用基于功效成分的特征断裂片段信息实现未知功效成分的筛查。首先，运用vDIA扫描模式获取保健品样品的质谱信息，利用功效成分碎裂片段的精确质量数列表进行提峰；然后，将捕集到的呈高斯分布且数据点大于10的色谱峰进行汇总，并与功效成分标准数据信息进行比对，明确未知化合物的归类；其次，通过分析质谱裂解途径、分子离子与碎裂片段信息确定未知化合物的元素组成与分子式；最后，利用标准物质进行确证并进行定量。

图3 芒柄花苷的高分辨质谱图Fig.3 HRMS spectrum of ononin

例如，在筛查样品中的功效成分时，利用异黄酮类与黄烷酮类的特征断裂片段(表2),从总离子流图中提取出色谱质谱信息(如图3)，例如1个碎裂片段m/z269.080 20与表2中异黄酮类的特征碎裂片段m/z269.080 84具有相同的质谱裂解途径，可判断该化合物为异黄酮类，结合分子离子与其相应碎裂片段的精确质量数、分子离子峰与其同位素的响应强度比值、分子离子峰与其相应碎裂片段的响应强度比值，确定该化合物分子式为C22H22O9。利用密度泛函理论分析该物质的断裂途径，并与质谱数据库信息比对，发现该未知化合物的碎裂片段断裂机理与芒柄花黄素相同，通过与标准物质的色谱质谱信息匹配，最终确定该化合物为芒柄花苷。

2.3 筛查方法的建立

筛查流程包括筛选与确证，判定依据为功效成分的标准谱库与其相应的化学标准物质。第一步，按照已优化方法对葛根保健品进行处理和检测，质谱扫描方式为数据可溯源的Full MS/vDIA；第二步，加载数据库；第三步，加载筛查方法；第四步，分析数据。

运用Exact Finder软件，对全扫描图与二级碎裂片段谱图进行处理，提取出化合物信息。峰面积阈值(Peak area threshold)设为Full MS/vDIA扫描模式对分子离子峰碎裂阈值的响应强度8.3×104。对于初步判断为功效成分的化合物进行特征断裂片段的提取与分析，进而得到结论。

通过同位素离子峰信息与二级碎裂片段丰度比进行确证，其中色谱共流出的同分异构体是确证难点。实验中葛根素-6″-O-木糖苷与葛根素芹菜糖苷的保留时间均为5.0 min，分子离子的质荷比均为549.160 27，其碎裂片段相同，但丰度比不同，可通过质荷比为313.069 76与351.085 38两个碎裂片段的响应强度比值进行区别与确证(如图4)。功效成分的主要组成元素(如C、H、O)具有同位素，如具有M+1特征(比分子离子多1个质量单位的峰)的13C。分子离子为天然丰度最高的同位素组合的离子，质谱上与之相对应的具有相同元素的其他同位素组成的离子峰称为同位素离子峰。分子离子峰与同位素离子峰的丰度比可应用于确证，如含有1个碳原子时，响应强度比[M]/[M+1]=100/1.1，当分子式中含有n个这类原子时，运用二项式(a+b)n计算同位素相对丰度。如图5，通过对比葛根素-6″-O-木糖苷的M+113C丰度比的理论值与实际值进行确证。分子离子峰与同位素离子峰丰度比的允许阈值(Allowed intensity deviation)设为10%。

图4 同分异构体葛根素-6″-O-木糖苷(A)与葛根素芹菜糖苷(B)的全扫描与二级碎裂片段比对Fig.4 Comparison of full scan and secondary fragmentation of puerarin-6″-O-xyloside(A) and mirificin(B) isomer

图5 葛根素-6″-O-木糖苷分子离子峰与同位素离子峰的理论值(A)与实际值(B)确证Fig.5 Theoretical(A) and experimental (B)spectra of puerarin 6″-O-xyloside

2.4 方法参数及样品检测

2.4.1 线性关系将15种功效成分的标准储备液用甲醇稀释成不同质量浓度的混合标准溶液，采用所建方法对稀释后的标准溶液进行测定，以峰面积与对应质量浓度绘制标准曲线。由表3可知，15种标准品的线性关系良好，相关系数(r2)均大于0.99。

2.4.2 灵敏度、回收率与相对标准偏差向空白样品中加入15种物质的混合标准溶液，在相同的筛查条件下进行加标回收实验，每个加标水平进行6次测定。根据欧盟2002/657/EC相关规定，采用确定限(CCα)与检测容量(CCβ)表示方法的灵敏度。由表3可知，15种化合物的CCα为0.01～1.15 μg/kg,CCβ为0.01～2.03 μg/kg;不同加标水平下的回收率为83%～110%，相对标准偏差(RSD)为2.1%～8.6%。

2.4.3 实际样品检测应用所建方法对样品中的功效成分进行定性定量，库外成分的定量是根据色谱峰面积以及黄酮总量计算得到(见表4)。结果显示，在样品中共检出16种物质，RSD均小于2.0%，运用所建方法筛查到的葛根素、大豆苷元、鸢尾苷、大豆苷4种物质为所建谱库外化合物，表明所建方法可行且有效。

表3 15种标准品的线性范围、相关系数(r2)、确定限(CCα)、检测容量(CCβ)、 回收率及相对标准偏差(n=6)Table 3 Linear ranges,correlation coefficients(r2)，CCα,CCβ,recoveries and relative standard deviations of 15 standards(n=6)

表4 样品中功能成分的定性定量检测结果(n=3)Table 4 Qualitative and quantitative results of functional components in food supplements of pueraria(n=3)

3 结 论

本研究通过建立标准谱库，结合二级质谱信息，以及对葛根保健品中可能存在的功效成分断裂机理进行研究，采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS建立快速测定葛根保健品中功效成分的方法，达到了非定向筛查目的，并得到两类功效成分的特征质谱碎裂片段(异黄酮类：m/z351.086 31，m/z269.080 84；黄烷酮类：m/z137.023 32，m/z303.086 31)，为检测葛根相关保健品中功效成分提供理论依据。实际样品检测结果显示，不但检出所建标准谱库中的12种物质，同时筛查出库外4种功效成分。所建方法可用于葛根保健品中未知功效成分的检测，同时也有望应用于其他食品中未知成分的检测。