陈美，戴伟东，李朋亮，朱荫，陈勤操，杨艳芹，谭俊峰*，林智*



基于柱前衍生化GC-MS的炒青绿茶加工过程中初级代谢物变化规律研究

陈美1,2，戴伟东1，李朋亮1,2，朱荫1，陈勤操1,2，杨艳芹1，谭俊峰1*，林智1*

1. 中国农业科学院茶叶研究所，农业部茶树生物学与资源利用重点实验室，浙江 杭州 310008；2. 中国农业科学院研究生院，北京 100081

茶叶中的一些初级代谢产物前人研究较少，为了探明在炒青绿茶加工过程中这些初级代谢产物的变化规律，本研究以龙井43品种为原料制作了炒青绿茶，并采用了基于柱前衍生化的气相色谱-质谱联用法（GC-MS）对其进行测定。结果共鉴定出60种化合物，其中相对含量较高的为有机酸类、糖类、糖类衍生物。偏最小二乘法判别分析模型可成功区分炒青绿茶各个加工工序，并筛选出了关键差异化合物26种，聚类分析结果表明，这26种化合物在加工过程中的含量变化规律可分为以下3类：高→低：2-酮戊二酸、阿拉伯糖、没食子酸、吡喃葡萄糖醛酸、甘油葡萄糖苷、核糖、半乳糖、果糖、葡萄糖、磷酸、4-酮葡萄糖、核糖酸-1,4-内酯、甘露醇；高→低→高：尿黑酸、蔗糖、肌醇半乳糖苷、苏糖酸、松二糖、核糖酸、肌醇和柠檬酸；低→高→低：赤藓糖-1,4-内酯、磷酸氧丙基酯、焦谷氨酸、奎尼酸、己二酸。有机酸主要呈现先上升后下降趋势，糖类除蔗糖外主要呈现下降趋势。

炒青绿茶；衍生化；气质联用（GC-MS）；初级代谢产物

根据干燥方式的不同，可以将绿茶分为炒青绿茶、烘青绿茶、晒青绿茶等。炒青绿茶是以翻炒的方式将绿茶炒至足干，从而达到干燥的目的，经炒干而成的绿茶通常香气鲜锐，滋味浓厚而又耐冲泡，深受消费者喜爱。内含成分是影响茶叶品质的重要因子。对于炒青绿茶来说，其在加工过程中内含物质的变化直接关系到茶叶的品质和风味[1]。多年来，对于茶叶内含成分的研究主要集中于次级代谢产物[2-3]，如茶多酚（儿茶素、酚酸、黄酮糖苷等）[4-5]、咖啡碱[6-7]、茶色素[8-9]等，这些内含成分对茶叶品质具有重要贡献。其实，除了这些前人研究较多的次级代谢产物外，茶叶中还存在一些极性较强的初级代谢产物，如糖类、氨基酸、有机酸等，对茶叶的品质风味亦有重要贡献[10-11]，但除氨基酸之外，初级代谢产物的研究一直较少，其中部分原因是对于茶叶中的这部分初级代谢产物缺乏完善的分析方法[11]。目前，茶叶中内含成分的常见分析手段有离子色谱法（IC）[12-13]、毛细管电泳法（CE）[14-15]、液质联用法（LC-MS）[16-17]、气质联用法（GC-MS）[18-19]等。但这些方法并不适用于茶叶中极性较强的初级代谢产物（如糖类、有机酸、氨基酸等）的测定[20]。

柱前衍生化GC-MS技术是在样品进行GC-MS分析前利用化学变换将目标物质修饰成类似化合物，从而使目标化合物极性和沸点降低，物质的挥发性和热稳定性增强，更方便于定性定量分析的一种分析技术[21]。衍生化方法很多，在食品研究领域，主要应用的衍生化方法就有烷基化法、硅烷化法、酰基化法和酯化法，原理是将烷基、硅烷基、酰基等基团引入待测物中（以取代活泼氢的方式），从而将目标化合物修饰成可被仪器准确检测的物质。例如GC-MS衍生化分析中最常用的硅烷化法，即衍生化反应时硅烷基取代待测物分子上的活泼氢，从而能够增强化合物挥发性和热稳定性，便于GC-MS分析。常用的硅烷化试剂有二甲基硅烷（DMS）、三甲基硅烷（TMS）、二氯二甲基硅烷（DMCS）、三甲基氯硅烷（TMCS）及六甲基二硅氨烷（HMDS）、,－双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）、-甲基--三甲基硅烷三氟乙酸盐（MSTFA）、,－双三甲基硅基乙酰胺（BTA）等[22]。

目前柱前衍生化GC-MS技术已经在烟草、蔬菜、水果、粮食等领域的研究中得到了较为广泛的应用，如Galbava等[23]以六甲基二硅胺烷（HMDS）和双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）为衍生化试剂，利用GC-MS研究比较了3种品牌香烟的灰分，鉴定出了每种品牌香烟的特征性成分；Hurtadofernández等[24]采用衍生化GC-MS技术分析了鳄梨成熟时的成分变化，鉴定出了脱落酸、亚油酸、天冬氨酸和甘露庚酮糖等与鳄梨成熟密切相关的化合物；许辉等[25]以三甲基氯硅烷、六甲基二硅胺烷、,－二甲基甲酰胺为衍生化试剂，联合GC-MS测定了内蒙古不同品种莜麦中可溶性和不可溶性非淀粉多糖的含量；在茶叶中该技术也有了初步的应用，如张磊等[26]采用衍生化GC-MS技术，同时结合LC-MS，对绿茶、红茶、乌龙茶的化学成分进行了分析。但该技术一直未被应用于茶叶加工过程的研究中。本研究拟将柱前衍生化GC-MS法应用于茶叶加工过程的研究，阐明炒青绿茶加工过程中初级代谢产物的变化规律，为炒青绿茶品质形成机理研究提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

炒青绿茶样品：茶样品种为龙井43，鲜叶于2016年5月13日采自浙江省杭州市西湖区龙坞镇，采摘标准为一芽二叶，并于当日经摊放→杀青→揉捻→干燥（炒干）等工序制成干茶；加工过程中将鲜叶、摊放、杀青、揉捻、干燥等5道工序分别取样，样品经液氮冷冻后进行真空冷冻干燥，然后于-20℃保存。

吡啶、甲氧胺盐酸盐和-甲基--（三甲基硅基）三氟乙酰胺（MSTFA）购自Sigma-Aldrich公司，均为色谱纯。

1.2 仪器与设备

6CST-40型滚筒杀青机购自浙江上洋机械有限公司；6CWC-100型炒青机购自福建省安溪佳友机械有限公司；6CR-Z45型茶叶揉捻机购自浙江春江茶叶机械有限公司；粉碎研磨机购自德国IKA公司；SQP电子天平购自赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；5810R高速冷冻离心机购自Eppendorf公司；FD5-10真空冷冻干燥机购自美国Gold SIM公司；DK-S11型电热恒温水浴锅购自上海森信实验仪器有限公司；GC-MS仪器（7890B-7000C）购自美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1样品前处理

茶汤浸提：将茶样于-20℃冰箱取出置于干燥箱中恢复至常温，然后磨成均匀的粉末，称取40 mg于3 mL离心管内，加入2 mL沸水，摇匀，浸提5 min，取上清液于5 000 r·min-1条件下离心10 min，之后取0.5 mL上清液于–20℃冰箱预冻后，转移至真空冷冻干燥机中冻干备用。每个样品3个重复。此外，本试验制备了空白样品和质量控制样（QC样）。空白样品为0.5 mL去离子水冷冻干燥获得。QC样品为每个茶汤移取0.3 mL混合后于5 000 r·min-1条件下离心10 min，取0.5 mL上清液于-20℃冰箱预冻后冷冻干燥获得。

衍生化处理：参考了文献[26]的处理方法并有所调整。将冻干样品取出，加入60 μL甲氧胺吡啶溶液（20 mg·mL-1），然后涡旋1 min，39℃条件下衍生1.5 h，之后再加入60 μL MSTFA于39℃条件下衍生0.5 h，最后将样本于9 000 r·min-1条件下离心10 min，取上清液进行GC-MS分析。空白样品和QC样品同样进行衍生化后进行GC-MS分析。

1.3.2 GC-MS条件

参考了文献[27]的GC-MS条件并进行了微调。

GC条件：GC柱采用HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样量：1 μL；程序升温：起始温度60℃保持3 min，然后以7℃·min-1的速度升温至290℃，保持5 min；进样口温度：280℃；进样模式：分流模式，分流比为10︰1；载气：高纯氦气；恒流模式，流量为1 mL·min-1。

MS条件：传输线温度：220℃；离子源：EI源，能量：70 eV；离子源温度：220℃；质量扫描范围：33~600 amu；溶剂延迟时间：6.3 min。

1.3.3 定性分析

GC-MS分析所得到的质谱数据经过计算机检索和NIST数据库提供的标准质谱图进行比对[28]，选择正反匹配度均大于600（化合物质谱图与NIST数据库正反匹配度均大于600则表明该化合物基于NIST数据库的鉴定结果可靠性尚好[29]）的予以进一步分析，并购买标准品进行验证。在空白样品中出现的峰，认为由衍生化试剂或者气相色谱柱高温条件下柱流失引起，在化合物峰表中进行剔除。

1.4 数据统计分析

数据前处理：采用Unknows Analysis II软件和Qualitative Analysis（安捷伦公司，美国）进行未知物分析检索，采用Quant Analysis软件（安捷伦公司，美国）进行化合物的积分，采用Excel软件进行聚类分析数据的前处理。

统计分析：经过前处理的数据采用Simca-P 11.5进行偏最小二乘判别分析、SPSS 18进行非参数检验以及采用MeV 4.9软件进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 基于柱前衍生化GC-MS的炒青绿茶内含成分分析

样品经过提取、冻干、衍生后即进行GC-MS分析。炒青绿茶GC-MS分析的典型总离子流色谱图如图1所示，可发现衍生化后的色谱峰分离良好。

对总离子流图进行分析，经过NIST数据库检索匹配以及进一步标准品验证，最终可鉴定60种化合物（表1）特征离子，该60种化合物特征离子中，有43种化合物只出一个峰，有17种化合物因为衍生过程中衍生位点的不同，而产生2个或2个以上的峰，具体结果如表1所示。由表1可以看出，这60种化合物可分为以下几类：有机酸类（乳酸、乙酰亚氨酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、甘油酸、苹果酸、焦谷氨酸、苏糖酸、己二酸、酒石酸、柠檬酸、2-酮戊二酸、莽草酸、粘酸、奎尼酸、没食子酸、尿黑酸）、糖类（木糖、阿拉伯糖、核糖、蔗糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、阿洛糖、来苏糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、鼠李糖、山梨糖、纤维二糖、甘露二糖、松二糖等）、糖类衍生物（甲基半乳糖苷、肌醇半乳糖苷、甘油葡萄糖苷、葡萄糖酸、核糖酸、阿拉伯糖酸、半乳糖醛酸、吡喃葡萄糖醛酸、4-酮葡萄糖、核糖醇、木糖醇、阿拉伯糖醇、甘露醇、半乳糖醇等）、内酯类（核糖酸-1,4-内酯、葡萄糖醛酸-内酯、赤藓糖-1,4-内酯等）、氨基酸类（蛋氨酸、天冬酰胺等）。这60种化合物大部分为茶叶中的初级代谢产物。有机酸类、糖类、糖类衍生物相对而言含量较高，分别占总峰面积的19.87%、14.66%、18.23%（此处百分比代表进行了峰面积归一化处理，即占GC-MS总出峰面积的相对比例，而非占茶叶含量的百分比重）。而在本次炒青绿茶样品所测得的化合物中，占总峰面积相对比例最高的为：肌醇半乳糖苷、奎尼酸、蔗糖、磷酸、葡萄糖、肌醇、草酸。

2.2 基于柱前衍生化GC-MS的炒青绿茶加工过程中内含成分变化规律分析

炒青绿茶品质的最终形成与内含成分的变化息息相关，前人对于炒青绿茶中茶多酚、茶色素等次级代谢产物在加工过程中的变化规律的研究已有所报道[2,8,11]，但对茶叶中初级代谢产物在炒青绿茶加工过程中变化规律的研究却甚少，

图1 基于衍生化GC-MS的炒青绿茶总离子流色谱图（以QC样为例）

表1 基于柱前衍生化GC-MS的炒青绿茶内含成分鉴定结果

注：*，这些化合物由于衍生后生成两个或两个以上的峰；a，该化合物已经过标样验证

Note:*,These compounds produce two or more peaks after derivatization. a, the compound has been verified by standard

续表1

本研究采用偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）结合聚类分析揭示炒青绿茶中一些关键性初级代谢化合物的变化规律。如图2-a所示，QC样品聚集于PLS-DA得分图的中央，表明样品提取、衍生化和GC-MS分析的重复性良好，结果可靠。PLS-DA模型可成功区分炒青绿茶的各个加工过程，且各加工过程呈逐步变化趋势，说明炒青绿茶加工过程中一些化合物的含量逐步发生变化。将载荷图（图2-c）与得分图（图2-a）对比也可以看出，本研究采用的基于柱前衍生化GC-MS方法所测得的成分中，大部分物质在加工过程中含量变化差异不明显（集中于载荷图中央），这与绿茶杀青灭酶阻止内含成分变化有关。大部分化合物在加工过程前期含量较高，在加工过程中含量降低（分散于载荷图左侧），部分化合物在加工过程后期含量较高，在加工过程中含量升高（分散于载荷图右侧）。

另外，如图2-b所示，该PLS-DA模型经60次交叉验证后，2=–0.408，2=0.040，表明该模型未过拟合，较为可靠。

变量重要性因子（Variable important for the projection，VIP）可以将PLS-DA模型中每一变量对判别分析的贡献值量化[30]，VIP值越大，说明该化合物在加工过程中含量的变化越大，对PLS-DA模型的分类贡献越大。本研究结合VIP值与Kruskal-Wallis（KW）检验，从已经鉴定出的60种化合物特征离子中，筛选出VIP值>1且KW检验<0.05的化合物共26种，为了清楚直观地展示这26种化合物在炒青绿茶加工过程中的变化规律，采用MeV 4.9软件对这26种化合物进行了聚类分析[31]。如图3所示，颜色越红，代表该化合物在这一加工过程相对含量越高，颜色越绿，代表该化合物在这一加工过程中相对含量越低。

图2 炒青绿茶内含成分PLS-DA得分图（a）、模型验证（b）及其载荷图（c）

图3 炒青绿茶加工过程中关键内含成分含量变化热图

从图3中可以看出，加工过程中内含成分相对含量的变化趋势可分为3类：高→低：2-酮戊二酸、阿拉伯糖、没食子酸、吡喃葡萄糖醛酸、甘油葡萄糖苷、核糖、半乳糖、果糖、葡萄糖、磷酸、4-酮葡萄糖、核糖酸-1,4-内酯、甘露醇这13种成分在鲜叶期和摊放期含量较高，从杀青期开始含量显著下降，然后一直维持低含量水平；高→低→高：苏糖酸、松二糖、核糖酸、肌醇、柠檬酸这5种成分在加工前期含量一直处于下降阶段，在揉捻过程中含量略微上升，干燥过程中含量显著升高，而尿黑酸、蔗糖、肌醇半乳糖苷这3种成分从鲜叶到摊放过程含量下降，从杀青开始，含量显著上升直至加工过程结束，相对于鲜叶中的初始量，总体表现为绿茶炒青加工后升高；低→高→低：赤藓糖-1,4-内酯、磷酸氧丙基酯、焦谷氨酸、奎尼酸、己二酸这5种成分在鲜叶和摊放过程含量较低，中间杀青和揉捻过程中含量显著上升，但在干燥之后的成品茶中含量又下降。刘冉霞等[32]的研究表明，球形绿茶在鲜叶→摊放→杀青→包揉→干燥该5道加工工序中，摊晾阶段可溶性糖含量呈增加趋势，包揉干燥时期含量有所下降；乔小燕等[33]对客家传统长炒青绿茶的研究表明，在鲜叶→萎凋→杀青→揉捻→动态失水→第一次长炒青→第二次长炒青等7道连续化生产线加工工序中，杀青揉捻阶段可溶性糖含量显著下降，这与本研究中果糖、半乳糖、核糖、阿拉伯糖、葡萄糖等可溶性糖在炒青绿茶加工过程中的变化趋势一致。

2.3 初级代谢产物与绿茶品质关系探讨

有机酸、糖类等初级代谢产物存在于很多天然植物、蔬果中，并与品质有着密切的关系。例如在苹果中就发现，总糖含量和山梨糖醇含量与苹果甜度呈显著正相关，而有机酸则与苹果甜度呈负相关[34]；葡萄柚中主要含有蔗糖、葡萄糖、果糖这3种糖，含量比为2∶1∶1，所含有机酸中柠檬酸含量最高，而有机酸与糖类的个体比例差异则很大程度的影响了葡萄柚的甜度与酸度[35]；中国杨梅汁经检测发现有机酸主要为酒石酸、奎宁酸、苹果酸、抗坏血酸、乳酸、乙酸、马来酸、柠檬酸和琥珀酸，糖类主要为蔗糖、果糖、葡萄糖，经过理化分析与感官审评，发现奎宁酸、马来酸、果糖、柠檬酸、乳酸、琥珀酸和蔗糖对杨梅汁的味道特征有显著贡献[36]。

同样，在茶叶中，也发现茶汤中如柠檬酸、草酸、苹果酸等有机酸呈酸味，果糖、葡萄糖等部分糖呈甜味[10]；刘爽等[37]在绿茶茶汤化学组分与滋味分属性相关性研究中发现，绿茶中有机酸总量与茶汤的鲜味呈正相关，而且有机酸总量在感官审评总评分较高的绿茶中含量也较高，而随着绿茶滋味品质的降低，其含量也逐渐减少。在本研究中，如图4所示，有机酸的变化趋势并不完全一致，柠檬酸和一些糖酸（核糖酸、苏糖酸等）在加工过程中呈现先下降后上升的趋势，而奎宁酸、焦谷氨酸、己二酸、尿黑酸等在加工过程中间阶段含量升高，之后又略微下降。在绿茶审评过程，酸味并不是绿茶的主要滋味特征，而鲜味普遍认为与氨基酸成分密切相关，因此有机酸与氨基酸的滋味互作关系及其对绿茶品质的贡献还需下一步深入研究。可溶性糖含量据文献报道在绿茶加工过程中呈现先大幅度下降，再上升的情况[38]。本研究中（图4），可溶性单糖（阿拉伯糖、核糖、果糖、半乳糖、葡萄糖）在加工过程中总体都呈下降趋势，尤其是杀青和干燥过程可显著降低其含量；但可溶性二糖蔗糖在鲜叶萎调过程中下降后，在杀青和干燥的过程中均显著上升，整体相较于鲜叶中的初始含量，其含量显著升高，提示绿茶加工过程中的加热步骤（杀青与干燥）可促进单糖向二糖转化。蔗糖是这6种可溶性糖中含量最高的，是可溶性糖单糖（阿拉伯糖、核糖、果糖、半乳糖、葡萄糖）含量的几倍至几十倍不等，因此，就可溶性糖总体含量而言，是符合先下降再上升的趋势的，这在一定程度上会减轻茶叶的苦涩味，增加其鲜甜感[39]。

3 结论

本研究以龙井43鲜叶为原料，依次经过摊放、杀青、揉捻、干燥（炒干）等加工工序制作成炒青绿茶，并以此为试验对象，采用MSTFA为衍生化试剂，进行了基于柱前衍生化GC-MS的内含成分分析及变化规律研究。研究表明，该方法可较为全面、准确地检测前人研究较少的茶叶中的初级代谢产物，并最终鉴定出了60种化合物特征离子，主要可分为5类，分别是：有机酸类18种、糖类17种、糖类衍生物14种、内酯类3种、氨基酸类2种，其中相对而言含量较高的类别为：有机酸类、糖类、糖类衍生物。

基于化合物的相对含量，建立了PLS-DA模型，结果表明内含成分在炒青绿茶加工过程中有所变化，并筛选出了VIP>1且KW检验<0.05的化合物共26种。对这26种化合物进行聚类分析，结果显示，这些化合物在加工过程中的变化规律可分为3类：相对含量“高→低”变化的有13种化合物，相对含量“高→低→高”变化的有8种，而剩下的5种化合物则是呈现由“低→高→低”的变化趋势；从化合物类别来看，在这26种化合物中，有机酸类和糖类占了21种，绝大部分为茶叶中的初级代谢成分，其中有机酸的总体变化较为复杂，既有先降后升趋势（柠檬酸、核糖酸、苏糖酸等），也有先升后降趋势（焦谷氨酸、己二酸、奎尼酸、尿黑酸等）；可溶性单糖，葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、核糖等在炒青绿茶加工过程中逐渐降低，尤其在杀青和干燥过程中显著降低，而蔗糖（可溶性二糖）的变化趋势是先降后升，尤其是在杀青和干燥过程中显著升高。

注：FL：鲜叶；W：摊放；F：杀青；R：揉捻；D：干燥

Note: FL: Fresh leaves, W: Withering, F: Fixation, R: Rolling, D: Drying

图4 有机酸和糖类在茶叶加工过程中相对含量变化情况

Fig.4 Relative content changes of organic acids and carbohydrates during tea processing

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Study on the Changes of Primary Metabolites During theManufacturing Process of Roasted Green Tea by Pre-column Derivatization Combining with GC-MS

CHEN Mei1,2, DAI Weidong1, LI Pengliang1,2, ZHU Yin1, CHEN Qincao1,2,YANG Yanqin1, TAN Junfeng1*, LIN Zhi1*

1. Key Laboratory of Tea Biology and Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

Few if any previous studies were carried out in the field of primary metabolite changes during the manufacturing process of roasted green tea. Longjing 43 was used to make roasted green tea and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) with derivatization was used to determine the components. A total of 60 compounds were identified, which included high levels of organic acids, carbohydrates and carbohydrate derivatives. Each steps of the processing could be successfully distinguished by partial least-squares discriminant analysis based on 26 key compounds. The results of cluster analysis indicated that the content changes of the 26 compounds could be classified into three categories: high-low: 2-ketoglutaric acid, arabinose, gallic acid,glucopyranosiduronic acid, glyceryl-glucoside, ribose, galactose, fructose, glucose, phosphoric acid, 4-ketoglucose, ribono-1,4-lactone, and mannitol. High-low-high: homogentisic acid, sucrose, galactinol, threonic acid, turanose, ribonic acid, inositol and citric acid. Low-high-low: erythrose-1,4-lactone, oxypropyl phosphate, pyroglutamic acid, quinic acid and hexanedioic acid. Organic acids mainly showed a rising and then downward trend. Carbohydrates except sucrose showed a downward trend.

roasted green tea, derivatization, gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), primary metabolites

S571.1；TS272.5+1

A

1000-369X(2019)03-297-12

2018-11-13

2019-01-13

中国农业科学院科技创新工程（CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS）

陈美，女，硕士研究生，主要从事茶叶加工品质化学方面的研究，chenxiaomei88520@163.com。*通信作者