陈慧勤，蔡克锋

(1.泉州医学高等专科学校，福建 泉州 362000；2.福建医科大学附属第二医院，泉州 362000)

据流行病学调查，我国肺心病的发病率较高，患病率达0.48%，在各种器质性心脏病中，肺心病所占的百分比约为18%～37%[1]。慢性肺源性心脏病进展过程中，心肌肥厚虽然在早期有一定的代偿作用，但持续过久则会引起心力衰竭甚至猝死，因此治疗心肌肥厚是医学界长期以来的难题。由于以往较常采用左心室心肌肥厚大鼠模型来进行研究，而野百合碱诱导的右心室心肌肥厚的模型报道很少，以往研究表明该方法诱导的右心室肥厚的机制与肺源性心脏病的病理生理变化过程最为接近[2]，且具有简单、可重复性好的优点，适用于研究肺源性心脏病病理生理学机制及相关药物的研究。本课题组前期的研究已经证实野百合碱(monocrotaline,MCT)诱导的右心室心肌肥厚与TPRC6通道的表达上调有关[3]。银杏叶提取物(ginkgo biloba extract,EGB)为传统中药银杏叶，采用现代制药工艺从中提其有效成分而制成的制剂如金纳多、银杏叶片等，已有研究表明EGB可多环节、多靶点地防治心脑血管疾病，有清除自由基、改善血液流变学、抗血小板聚集、抗炎、调节血脂、防治动脉粥样硬化、保护线粒体和减少组织耗能等作用[4]。本研究旨在通过建立MCT诱导的大鼠右心室心肌肥厚EGB早期干预模型探讨银杏叶提取物对MCT诱导的心肌肥厚的早期保护作用，并观察银杏叶提取物对TRPC6的表达的影响从而探究EGB对于心肌肥厚防治作用的病理生理学机制。

1 材料与方法

1.1 主要药品与试剂

金纳多银杏叶提取物(德国威玛舒培博士药厂)，野百合碱(Aladdin，上海);水合氯醛(Aladdin，上海)，TRIzol(碧云天，中国)，兔抗TRPC6抗体(Abcam，美国)，兔抗β-actin(Abcam，美国)，ECL增强化学发光检测试剂盒，30%丙烯酰胺(29∶1，上海生工)，甲基磺酰氟(PMSF，Sigma，美国)，过硫酸铵(Amresco，美国)，十二烷基硫酸钠SDS(Amresco，美国)，甘氨酸(Amresco，美国)，溴酚蓝(Amresco，美国)，巯基乙醇(Amresco，美国)，TEMED(Amersham Pharmacia Biotech，美国)。

1.2 模型制备及给药方法

健康清洁级雄性SD大鼠(180～200)g 72只随机平均分为3组：对照组(CON组)、野百合碱诱导右心室心肌肥厚组(MCT组)、银杏叶提取物治疗组(EGB组)。MCT组与EGB组首日均以2%MCT按60 mg/kg 剂量腹腔注射，注射后第2日开始，MCT组每日予2 ml 0.9% NaCl注射液灌胃，EGB组以60 mg/kg银杏叶提取物灌胃,对照组SD大鼠首日一次性腹腔注射2 ml 0.9% NaCl注射液,注射后第2日起常规饲养3周。

1.3 血液动力学检测

SD大鼠以氨基甲酸乙酯腹腔麻醉、固定、分离右颈外静脉，选择PE50管连接RM6240生物机能实验系统，行右心室插管法测量平均右心室收缩压(mean right ventricular systolic pressure，mRVSP)、心率(heart rate,HR)、体循环平均充盈压(mean systemic arterial pressure，mSAP)和右心室压力最大上升/下降速率(right ventricular pressure maximum rate of rise/descent，RV±dp/dtmax)。

1.4 右心室重量指数测定

大鼠测定血液动力学指标后迅速开胸取出心脏。沿房室交界处分离右心室(right ventricular，RV)及左心室+室间隔(left ventricularventricular septum，LV+S)，称重后计算RV/(LV+S)即右心室重量指数(right ventricular mass index，RVMI)。

1.5 心肌组织病理学形态观察

测完RVMI后剪下SD大鼠心尖部的右心室心肌组织迅速固定后脱水、石蜡包埋、HE染色，制作病理切片，并于光镜下观察心肌病理改变。

1.6 RT-PCR检测TRPC6 mRNA表达水平

各组心室组织块在液氮中充分研磨后，按照TRIzol试剂盒说明书的方法提取总RNA，后使用Takara试剂盒进行逆转录。用β-actin作为内参进行实时定量PCR，TRPC6 引物(上海生工合成)序列如下：TRPC6上游引物5＇- GACAGAAATCAGCTGGCACA -3＇，TRPC6下游引物 5＇- TCCCCTTCGTTCACTTCATC -3＇。置于 PCR 仪中按照预变性、变性、退火、延伸的过程进行扩增并根据测得的 Ct 值求得各样本TRPC6的相对表达水平。

1.7 Western blot 检测心肌组织TRPC6 的蛋白表达

各组大鼠心肌组织提取蛋白，BCA 法进行蛋白定量，制备凝胶，上样，电泳，转膜，封闭，加一抗(兔抗β-ACTIN 1∶1 000;兔抗 TRPC6 1∶500)，置于摇床4℃孵育过夜，后加二抗(羊抗兔1∶1 000)室温孵育1 h。将膜放于化学发光成像仪中，加ECL 发光液，显影，成像。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 各组血流动力学指标比较

MCT组及EGB组的平均体循环动脉压及心率，无显著差异，MCT组的RVSP显著升高，右心室内压力最大上升速率(right ventricular pressure maximum rate of rise，RV+dp/dtmax)显著增加，右心室内压力最大下降速率(right ventricular pressure maximum rate of descent，RV-dp/dtmax)显著下降(P<0.01,表1)；而EGB早期干预组虽然与MCT组的各项指标有相同趋势的变化，但是EGB组各项指标变化的幅度均显著降低(P<0.01,表1)。

CON：Control;MCT:Monocrotaline-induced right ventricular hypertrophy group;EGb：Ginkgo biloba extract treated group;RVSP:Right ventricular systolic pressure;mSAP：Mean systemic arterial pressure;HR：Heart rate;RV+dp/dtmax：Right ventricular pressure maximum rate of rise;RV-dp/dtmax：Right ventricular pressure maximum rate of descent
**P<0.01vsCON group

2.2 各组心脏重量指数比较

CON组RVMI为(28.32±1.31)%，与CON组相比，MCT组RVMI显著升高至(47.99±3.83)%(P<0.01)，EGB组RVMI也显著升高至(34.49± 1.49)%，但较MCT组显著降低(P<0.01)。

2.3 各组病理形态学结果比较

HE染色可见CON组大鼠右心室心肌细胞胞核清晰，心肌纤维边缘整齐，排列有序。(图1A)。MCT组右心室心肌细胞排列紊乱，心肌纤维粗大，细胞核深染，形状不整(图1B)。EGB组右心室心肌细胞较MCT组有显著改善(图1C，图1)。

2.4 右心室心肌组织TRPC6 mRNA相对表达水平比较

实时定量RT-PCR结果显示，与CON组相比，MCT组TRPC6 mRNA相对表达水平显著升高(P<0.01,n=24),而EGB组TRPC6 mRNA相对表达水平较CON组显著升高，但是较MCT组显著降低(P<0.01,n=24，表2)。

2.5 右心室心肌组织TRPC6蛋白表达水平比较

Western blot免疫印记法以β-actin为内参对大鼠右心室心肌组织上 TRPC6 通道蛋白的表达进行定量分析,与CON组相比，SD大鼠右心室TRPC6蛋白相对表达水平在MCT组显著升高(P<0.05,n=4)，而 EGB组TRPC6蛋白相对表达水平较MCT组则显著降低(P<0.05,n=4，图2，表2)。

Fig.2TRPC6 protein expression in right ventricular of each group

A:CON group;B:MCT group;C:EGB group

Tab. 2 The mRNA and protein expression level of

*P<0.05，**P<0.01vsCON group

3 讨论

本实验结果通过血流动力学变化可以观察到MCT给药三周使得大鼠RVSP及RV±dp/dtmax显著升高，提示大鼠右心室的收缩、舒张功能代偿性增强；RVMI显示大鼠右心室重量指数显著升高；且右心室心肌组织切片HE染色可见右心室心肌细胞排列紊乱，心肌纤维粗大，细胞核深染，以上结果显示大鼠右心室心肌肥厚模型成功建立。心肌肥厚是多种心脏疾病共同的病理过程，发病初期表现为代偿性心肌纤维增粗，心肌收缩舒张功能增加，但是长期将引起失代偿、心衰甚至死亡。在心肌肥厚发生发展过程中，钙离子内流在心肌肥厚中是引发心肌肥厚和凋亡的重要原因之一[5]，以往的研究已经证实TRPC亚家族(canonical transient receptor potential,TRPC)与ROCC、SACC和SOCC三种Ca2+通道有关，而在ROCC通道中，TRPC6是其主要的分子基础[6]。PLC被药物等外界刺激激活后可进一步分解为三磷酸肌醇(IP3)和二酰基甘油(DAG)，后者能激活ROCC，并调控ROCC介导的钙离子内流，从而引起下游的钙调磷酸酶/NFAT信号通路激活介导心肌肥厚[7]。有研究已经证明 TRPC介导的 Ca2+-NFAT信号通路的激活可以诱导心肌肥厚的发生[8]，且新生期大鼠的心肌细胞中敲除 TRPC6能够抑制 NFAT 的激活和逆转心肌肥厚[9]，证明TRPC6与心肌肥厚的发生有关。

近年来越来越多的研究发现EGB可通过清除自由基与抗氧化、改善血液流变学和抗血小板聚集、急性冠脉综合征患者的炎症因子水平、减轻动脉粥样硬化的炎症反应、调节血脂、防治动脉粥样硬化、保护线粒体和减少组织耗能以上相关机制起到预防心肌肥厚的作用，且已证明EGB在治疗冠心病、心力衰竭、心律失常等方面的显著疗效[10-12]，但鲜有文章报导其在治疗心肌肥厚方面是否也有作用。因此，本课题组初探EGB对心肌肥厚是否有治疗作用，并在此基础上探索其可能的机制。

本实验结果从血流动力学变化、心脏重量指数方面证实造模初期用EGB预处理可明显改善心肌肥厚血流动力学的相关指标，又通过HE染色观察到其对心肌病理形态学也有显著改善，可初步判断EGB预处理可预防心肌肥厚的发生发展。在分子生物学机制探索中，RT-PCR 和Western blot 结果显示，EGB组较MCT组大鼠心肌组织TRPC6的基因及蛋白的表达含量显著降低，据此推论，EGB预防心肌肥厚可能是通过降低TRPC6的含量后使ROCC介导的Ca2+内流减少，并进而抑制钙调抑制磷酸酶/NFAT信号通路,故EGB对心肌肥厚的预防作用可能与下调TRPC6有关。