沈国蔚，成心锟，颜世昌，张俊，丁惠民

（南京医科大学附属明基医院骨科，江苏 南京 210019）

囊性纤维化（Cystic fibrosis，CF）是一种常见的常染色体隐性遗传病，是由于囊性纤维化跨膜传导调节因子（Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）编码的基因突变引起的严重疾病，近年来亚洲发病率约1/10万，呈上升趋势[1，2]。CFTR是一种cAMP依赖的氯离子通道蛋白，广泛表达于各组织的上皮细胞，介导离子和水分在上皮细胞的分泌和转运。CFTR功能异常是引起CF患者多系统病变的主要原因，主要临床症状为CFTR功能异常所致脂类及其它营养素的吸收障碍、胰腺衰竭以及慢性感染或者细菌引起的二重感染导致的严重肺部功能障碍[3，4]，严重影响患者的生存质量。近年来研究表明，CFTR参与上皮细胞的凋亡过程[5]。然而CFTR和骨细胞凋亡的关联研究尚未有报道，而本研究主要目的是探讨CFTR在破骨细胞中的表达，以及CFTR对破骨细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

人支气管细胞系16HBE14，人破骨细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，胎牛血清及双抗（青霉素、链霉素）购自美国Gibco公司，DMEM细胞培养基购自美国Hyclone公司，PVDF膜购自美国 Sigma公司，Lip2000、SYBR Premix Ex TaqTM II试剂盒购自日本TaKaRa公司，Annexin-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自凯基生物，CTFR、自杀相关因子（Factor associated suicide，Fas）、Fas 配体（Fas ligand，FasL）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde -3 -phosphate dehydrogenase，GAPDH），二抗购自美国Cell Sigaling Technology公司。主要仪器：细胞培养箱购自美国Thermo公司，FACSCanto流式细胞仪购自美国BD公司，Elx800型自动酶标仪购自美国BioTek公司，7300型定量PCR仪购自美国ABI公司，Mini PROTEAN 3小型垂直式电泳仪购自美国Bio Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养和转染

用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 g/ml链霉素的DMEM培养基培养人支气管细胞系16HBE14和破骨细胞，于37℃、5%CO2恒温密闭细胞培养箱中培养。每隔2-3天换液1次，待融合70%-80%时，用胰蛋白酶消化传代进行后续实验。

1.2.2 RNA提取和real-time RT-PCR

TRIzol法提取细胞的总RNA按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录获得cDNA，以cDNA为模板进行RT-PCR，检测CFTR mRNA表达水平。Real-time RT-PCR按照Roche FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）说明书进行，相对基因表达采用2-ΔΔCT 法计算[7]。

1.2.2 蛋白质印迹检测（Western Blot）

细胞经RIPA裂解液裂解提取蛋白，运用BCA蛋白检测法对蛋白进行定量检测，经SDS-PAGE电泳后转PVDF膜，室温5%脱脂牛奶封闭1 h。然后加入一抗4℃孵育过夜，再加入HRP标记的二抗室温孵育1 h。采用化学发光凝胶成像系统检测，Adobe Photoshop CS4软件对条带进行灰度扫描检测。目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正误差，所得结果代表目的蛋白相对表达量。

1.2.3 流式细胞术

将人支气管细胞系16HBE14和破骨细胞细胞接种6孔培养板中，1×106/孔，待转染后，PBS冲洗后，加入Annexin V-FITC和PI，15 min后采用流式细胞仪检测各组的细胞凋亡率。

1.3 统计学方法

实验数据应用SPSS 20.0进行统计学分析。两组之间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析（one-way-ANOVA）进行比较，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CFTR在破骨细胞中的表达

利用Real time PCR和Western Blot的方法，研究体外培养的人破骨细胞中CFTR的表达，并以人支气管细胞系16HBE14为阳性参照。结果显示（图1a和1b），人破骨细胞无论是mRNA水平还是蛋白水平均有表达，但是较人支气管细胞系16HBE14B的表达水平较低。

图1 CFTR在破骨细胞中的表达

2.2 CFTR对破骨细胞凋亡的影响和机制

2.2.1 构建CFTR超表达载体

运用基因工程手段[8]构建含有GFP的CFTR超表达载体，通过病毒感染的方法导入体外培养的人破骨细胞中，从基因水平上调CFTR的表达，Western Blot验证CFTR蛋白表达上调，证明载体转染成功（图2）。

图2 构建CFTR超表达载体

2.2.2 超表达CFTR对破骨细胞凋亡的影响

应用流式细胞仪检测CFTR超表达后对破骨细胞凋亡率的影响，图3结果显示，SiRNA转染组的凋亡率较对照组和空白转染组显著提高。结果证明，转染后超表达CFTR，会促进破骨细胞的凋亡。

2.2.3 超表达CFTR对破骨细胞中Fas/FasL表达的影响

利用Real-time PCR和Western Blot法检测体外培养破骨细胞Fas/FasL的表达，结果显示：转染组凋亡相关蛋白Fas及FasL的表达，无论是mRNA水平还是蛋白水平，均较对照组及空白转染组升高更为明显。说明转染后，CFTR高表达，通过促进凋亡相关蛋白Fas及FasL的表达，进而促进破骨细胞的凋亡，见图4。

图3 超表达CFTR对破骨细胞凋亡的影响

图4 超表达CFTR对破骨细胞Fas/FasL表达的影响

3 讨论

CF是一种常见的常染色体隐性遗传病，是由于CFTR编码基因突变引起的严重疾病，发病率约1/10万[1,2]。CFTR是一种cAMP依赖的氯离子通道蛋白，广泛表达于各组织的上皮细胞，介导离子和水分在上皮细胞的分泌和转运。CFTR功能异常是引起CF患者多系统病变的主要原因，主要临床症状为CFTR功能异常所致脂类及其它营养素的吸收障碍、胰腺衰竭以及慢性感染或者细菌引起二重感染所致严重的肺部功能障碍[3,4]，严重影响患者的生存质量。近年来研究表明，CFTR参与上皮细胞的凋亡过程。在呼吸系统中，Durieu等[5]发现CFTR可以通过Fas和FasL促进气道上皮细胞凋亡；在消化系统中，Rottner等[6]研究发现CFTR异常表达会导致胰腺细胞过度氧化应激引起凋亡增高；而在生殖系统中，研究发现CFTR在性激素刺激下高表达可能引起子宫内膜细胞凋亡的增加，进而影响子宫内膜容受性[7]。

然而，CFTR和骨细胞凋亡的关联性尚有待深入研究。有学者发现，CFTR蛋白在人骨组织成骨细胞和破骨细胞中均有表达，主要定位在成骨细胞和破骨细胞的细胞浆中[8]。Bronckers等[9]在人和小鼠的成釉质细胞、成牙质细胞以及骨细胞中，也发现了CFTR的表达。这些结果提示，CFTR在骨质维持中发挥一定的作用。最近，有研究对CFTR在骨代谢中的作用展开了进一步研究，发现在体外培养的成骨细胞中，CFTR蛋白特异性抑制后会下调OPG并上调PGE2的表达，提示CFTR可能直接在骨组织中发挥作用，影响骨形成和骨吸收的稳态[10,11]。因此，对骨组织中CFTR蛋白在维持骨代谢功能的深入研究，对于阐明CF骨病的发生具有重要意义。本研究利用Real time PCR和Western Blot的方法，研究体外培养的人破骨细胞中CFTR的表达，并以人支气管细胞系16HBE14为阳性参照。结果显示，CFTR在人破骨细胞低表达，进而利用转染技术，使破骨细胞高表达CFTR，且高表达CFTR促进了破骨细胞的凋亡。

研究表明，Fas/FasL途径在细胞凋亡过程中起着十分重要的作用。它是TNF家族成员中，凋亡机制涉及范围最广泛的一条死亡相关受体通路。Fas是属于TNF受体（TNFR）家族的一种膜受体，其配体FasL（CD95L）属于TNF家族[12]。我们利用Real-time PCR和Western Blot法检测过表达CFTR后破骨细胞中Fas/FasL的表达，结果显示：转染组凋亡相关蛋白Fas及FasL的表达，无论是mRNA水平还是蛋白水平，较对照组及空白转染组，均表达升高。总之，本研究初步发现CFTR通过促进Fas/FasL的高表达，进而促进破骨细胞凋亡。