王犁烨 - 王浩臣 - 马 珊 刘维兵 - 李泽涵 -宋晶晶 - 杨华峰 - 张 颖 武 运

(1. 新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2. 新疆维吾尔自治区科技项目服务中心，新疆 乌鲁木齐 830011；3. 新疆仪尔高新农业开发有限公司，新疆 焉耆 841000；4. 吐鲁番市质量与计量检测所，新疆 吐鲁番 838000)

随着消费者对饮食健康及养生关注度的不断加深，中国葡萄酒的需求量逐年增长，酿酒工业呈现快速发展态势[1]。新疆作为中国最古老的葡萄种植产区，地区生态环境独特，区位优势明显，是发展酿酒葡萄的理想产区[2]。但该地日温差大、降雨量少，使得酿酒葡萄原料具有糖高酸低的特点，酸度过低会使葡萄酒颜色黯淡无光，口感单调、不清新，直接影响到新疆地区葡萄酒的品质[3-5]，因此需要选育高产酸的酵母菌株进行发酵，改善葡萄酒酸度低的现状。

目前，通常采用传统分离筛选的方法从自然界中筛选酿酒酵母菌株，但分离得到的野生菌株在发酵性能和功能上都具有一定的局限性。因此需要对已知菌株进行诱变，从基因层面上改变酵母菌的性质及功能，从而达到生产需要[6-8]。传统的诱变方法操作复杂，对人体和环境存在一定的危害，新型常压室温等离子体(ARTP)生物诱变育种技术，因其操作简单，对人体环境无毒无害，已成为生物诱变育种领域的一个研究热点[9-11]。赵宇等[12]、曲文娟等[13]、秦艳飞等[14]采用ARTP对高核酸酿酒酵母、产蛋白酶菌株以及产恩拉霉素菌株进行处理，获得生产所需的诱变菌株，但目前还没有学者通过ARTP筛选高产酒精和酸的酿酒酵母。

本试验拟以从葡萄表面筛选的Y6菌株为出发菌，通过ARTP诱变对其功能进行改造，以期获得高产酒精及酸且发酵性能稳定的目标酿酒酵母菌株，通过微生物代谢来增加葡萄酒的酒精度和酸度，以提高新疆葡萄酒品质。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

酵母菌株Y6：新疆农业大学食品科学与药学学院微生物实验室提供；

酵母浸粉、蛋白胨、琼脂粉：北京奥博星生物技术有限责任公司；

葡萄糖、无水乙醇、：分析纯，天津市致远化学试剂有限公司；

2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetra-zolium chloride，TTC)：分析纯，上海蓝季生物科技发展有限公司；

溴甲酚绿：分析纯，天津市北联精细化学品开发有限公司；

马铃薯葡萄糖琼脂：青岛高科园海博生物技术有限公司；

磷酸二氢钾、硫酸镁(MgSO4·7H2O)：分析纯，天津市光复科技发展有限公司。

1.1.2 培养基

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose medium, YPD)：20 g葡萄糖+20 g蛋白胨+10 g酵母浸粉+20 g琼脂+1 000 mL 蒸馏水；

TTC上层培养基：0.05 g TTC+0.5 g 葡萄糖+2 g 琼脂+100 mL 蒸馏水；

TTC下层培养基：10 g 葡萄糖+2 g 蛋白胨+ 5 g 酵母浸粉+1 g KH2PO4+0.4 g MgSO4·7H2O+20 g 琼脂+1 000 mL 蒸馏水，调pH为5.5～5.7；

溴甲酚绿培养基：PDA基础培养基+0.01%溴甲酚绿，调pH为 6.0。

1.1.3 仪器与设备

常压室温等离子诱变仪：ⅡS型，无锡源清天木生物科技有限公司；

分析天平：FA2014N型，北京东南仪诚实验室设备有限公司；

立式高压灭菌器：LDZX-50KBS型，上海申安医疗器械厂；

生物安全柜：HR40-A2型，青岛海尔特种电器有限公司；

霉菌培养箱：MJX-160-Z型，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；

紫外可见光光度计：TU-1810型，北京普析通用仪器有限责任公司；

PH计：FE20 PLUS型，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司；

手持糖度计：PAL-1型，北京阳光亿事达科技有限公司；

漩涡混合器：VORTEX-5型，华利达实验设备有限公司；

离心机：SF-TDL-6A型，上海菲恰尔分析仪器有限公司；

葡萄酒全自动检测仪：Y15型，西班牙Biosystem公司。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液的制备 首先挑取一环存放于冰箱的Y6酵母菌接种于YPD液体培养基中，在28 ℃下培养24 h；然后将菌液以2%的接种量接入新配的YPD液体培养基中，在28 ℃下培养24 h后，制得菌悬液。

1.2.2 Y6酵母生长曲线的测定 将活化好的Y6菌液以5%的接种量接种到YPD液体培养基中，在28 ℃下培养，每间隔2 h取1次样，在波长600 nm测吸光值，以空白培养基为对照，根据测得的吸光值绘制Y6酵母的生长曲线，确定Y6酵母的生长对数期。

1.2.3 ARTP诱变试验 试验参数：选择纯度为99.999% 的氦气作为工作气体，流量为10 SLM，电源功率设定为120 W，操作温度20 ℃，处理时间分别为0，20，40，60，80，100，120，140 s。诱变试验：在超净工作台中吸取1 mL 在液体培养基中培养至对数期的出发菌株Y6的菌液，在3 000 r/min 离心10 min，弃上清液，用无菌生理盐水洗涤3次后吸取10 μL放在载片上，用无菌镊子将载片依次放在对应的凹槽中，并将装有1 mL YPD液体培养基的EP管固定在下方，即可进行诱变试验，诱变后将装有载片的EP管放在漩涡器上剧烈震荡1 min，将诱变菌洗脱下来，梯度稀释10-6～10-7后，吸取100 μL涂布在平板上，在28 ℃培养箱中避光培养48 h，计算致死率，选择最佳诱变时间。

1.2.4 致死率计算

(1)

式中：

Z——菌株的致死率，%；

X1——ARTP诱变后的菌落数；

X——对照组的菌落数。

1.2.5 高产酒精及酸酿酒酵母初筛

(1) TTC培养基筛选：采用划线法将挑选出的突变菌株接种于TTC下层培养基中，在28 ℃条件下培养48 h 后，在TTC下层培养基上覆盖一层TTC上层培养基，并于28 ℃的条件下培养3 h，观察培养皿中的显色情况，从中筛选出产酒精能力强的突变菌株。

(2) 溴甲酚绿培养基筛选：先在培养皿中倒入一层刚好可以覆盖培养皿底部的溴甲酚绿培养基，待其凝固后放入牛津杯，再在牛津杯外围倒入一层溴甲酚绿培养基，培养基凝固后取出牛津杯，将TTC培养基筛选出的颜色较深的酵母菌株进行活化，将吸取100 μL 菌液环接种于牛津杯空洞内，在28 ℃条件下培养24 h，观察黄色圈，选择菌落周围出现较大黄色圈的菌株进行发酵能力试验。

(3) 菌株发酵能力测试：两步筛选出的突变酵母菌株，以5%的接种量分别接种于装有10 mL YPD液体培养基的试管中后，放入杜氏小管，并确保杜氏小管内无气泡，在28 ℃的条件下培养，每12 h观察一次突变菌株产气情况，记录杜氏小管内的填充度。根据试验结果，筛选出发酵性能好，起酵快、生长旺盛的菌株。

1.2.6 高产酒精及酿酒酵母的复筛 将葡萄汁115 ℃，灭菌20 min，分装在5个三角瓶中，每瓶150 mL，测定葡萄汁的糖度为23.6 Brix，总酸为4.94 g/L。将上几步筛选的诱变菌株和出发菌株同时以5% 的接种量接种于葡萄汁中，在25 ℃条件下培养10 d，测定菌株产酒精和产酸能力，确定目标菌株。

1.2.7 遗传稳定性试验 将突变酵母菌株连续传代培养5次，将每一代菌株以5%的接种量接种于糖度为22.8 Brix，总酸为5.32 g/L的葡萄汁中，在28 ℃条件下培养10 d，测定突变菌株的产酒精和产酸能力，从而验证菌株的突变性能是否能够稳定遗传。

1.3 数据处理

试验数据通过 Excel 2018 软件及 Origin 8.5 软件进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 Y6酵母菌生长曲线

酵母菌株所处的生理状态在一定程度上影响了菌株诱变的效果，酵母菌处于对数生长期时，其个体之间的形态、化学组成和生理特性等基本一致，数目以稳定的几何指数增长且对环境因素的作用十分敏感[15-16]。因此，在此阶段进行诱变，可以增加基因突变、稳定遗传的几率[17]。如图1所示，将Y6酵母菌接入液体培养基中，前4 h 酵母菌处于迟缓期，微生物的代谢系统需要适应新环境，因此数目增长缓慢。在4～16 h酵母菌数量增长迅速处于对数生长期，在16 h后酵母菌进入稳定期，因此本试

图1 Y6酵母菌生长曲线

验选择在10 h时对酵母菌进行诱变试验。

2.2 最佳诱变时间的确定

诱变处理剂量或时间不仅影响致死率，同时影响突变效率，在一个合适的突变效率区间进行有效的筛选是菌种选育的关键之处[18]。如图2所示，随着常压室温等离子体处理时间的延长，Y6酵母的致死率急剧升高，当处理时间为100 s时，致死率达到98.7%，当处理时间为120 s 时，酵母菌无一存活，说明常压室温等离子体产生的活性粒子能够破坏细胞结构，也能够穿过细胞壁到达细胞内打断基因、蛋白质分子等，从而导致大部分微生物死亡[19]，但当能量适中时，少数经过ARTP照射的酵母菌会通过本身的自动修复系统进行修复，由于细胞中DNA的不完全修复可能会引起控制产生目标性状功能的遗传片段发生改变，从而导致性状功能发生改变[20-21]。一般认为出发菌株稳定时，选用致死率在90%以上菌株，以求得突变幅度较大的目标菌株[22]，因此试验选择处理时间为100 s，致死率为98.7%的诱变菌株。

2.3 高产酒精及酸酿酒酵母初筛

2.3.1 TTC培养基的筛选结果 TTC作为一种显色剂，能对酵母的代谢产物发生显色反应，并且通过反应颜色的深浅来判断酵母中呼吸酶活力大小，从而判断酵母产酒精能力的高低。通常情况下，产酒精能力越强的酵母菌株在TTC培养基上显现的颜色越深。采用划线法将39株诱变菌株接种到TTC培养基上，结果如表1所示，Y6-5、Y6-8、Y6-10、Y6-14、Y6-15、Y6-17、Y6-28、Y6-31、Y6-32、Y6-33、Y6-35，11株菌株显色最为明显，为深红色，比出发菌Y6显现的颜色更深，说明这11株酵母菌株在经过等离子体处理后，产酒精能力有所增强。而Y6-3、Y6-6、Y6-11、Y6-27、Y6-34、Y6-39，这6株酵母菌都和出发菌Y6显色一致，为红色，但为了进一步了解株菌的产酸能力是否提高，将筛选出的11株深红色酵母菌进行溴甲酚绿培养基筛选试验。

图2 处理时间对Y6酵母菌致死率的影响

2.3.2 溴甲酚绿培养基的筛选 溴甲酚绿一般被用作酸碱指示剂，当pH值在3.8时，显现出黄色；当pH值在5.4时，显现出蓝绿色。将溴甲酚绿加入培养基中，可以判断酵母菌株产酸能力的强弱。将TTC筛选出的17株菌株接种到溴甲酚绿培养基中，结果如表2所示，Y6-8、Y6-10、Y6-14、Y6-15、Y6-28、Y6-31、Y6-33这7株诱变菌株在溴甲酚绿培养基上的黄色圈均大于出发菌株Y6，可以初步判断这7株突变菌株的产酸能力强于出发菌株。

表1 39株诱变酵母菌株TTC培养基筛选结果†

† “++++”表示深红色；“+++”表示红色；“++”表示粉色；“+”表示浅粉色；“-”表示无色。

表2 11株诱变酵母菌株溴甲酚绿培养基筛选结果

2.3.3 杜氏小管筛选 将上步筛选出的7株诱变菌株接种在装有杜氏小管的试管中，当12 h时，菌株Y6-15和Y6-33的杜氏小管中产气较多，其他诱变菌株均无明显反应；当24 h时，菌株Y6-8中的杜氏小管充满了气体，并且杜氏小管浮在液面上，Y6-31和Y6-33与出发菌株Y6的产气能力相同，在杜氏小管中有4/5的气体，其他菌株的产气能力相对较弱；当36 h时，除Y6-15和Y6-28之外，其他菌株都将杜氏小管中充满气体；在36，48 h时，所有菌株都将杜氏小管中充满气体。综上所述，可以判断7株诱变菌株的起酵能力为：Y6-8>Y6-33=Y6-31>Y6-15>Y6-10>Y6-28，因此初步确定Y6-8为目标菌株。

2.4 诱变菌株复筛

将7株菌株分别接种到葡萄汁后，其产酒精产酸情况如表4所示，与出发菌株相比，诱变菌株的产酸产酒精能力明显增强，与初筛结果一致，说明ARTP处理能够改变菌株的某些基因，从而改变菌株的功能。6株菌株产酒精能力依次为：Y6-8>Y6-31>Y6-15>Y6-33>Y6-10>Y6-28；6株突变菌株的产酸能力也存在一定的差别，其能力强弱依次为：Y6-8>Y6-15>Y6-31>Y6-33>Y6-28>Y6-10，但菌株产主要有机酸种类基本一致，为L-乳酸、酒石酸以及苹果酸。由此可以猜测菌株经过ARTP处理后，虽然产酸能力的强弱得到了改变，但产主要有机酸种类不会发生改变。GB 15037—2006 《葡萄酒》中限定葡萄

表3 6株诱变酵母菌株杜氏小管60 h间产气情况†

† “+++++”表示杜氏小管中充满气体；“++++”表示杜氏小管中充满4/5的气体；“+++”表示杜氏小管中充满1/2的气体；“++”表示杜氏小管中充满1/3的气体；“+”表示杜氏小管中充满1/5的气体；“-”表示杜氏小管中无气体。

表4 6株诱变酵母菌株与出发菌株产酒精产酸情况

酒中挥发酸≤1.2 g/L，以上菌株均符合要求，因此，最终将Y6-8确定为目标菌株。

2.5 遗传稳定性试验

将突变菌株Y6-8培养5代，把每一代菌液接种到葡萄汁中发酵10 d，发酵液的酒精度和总酸分析结果见图3。由图3可知，第3代菌株产酒精能力最强为12.7%vol，第5代菌株产酸能力最强为2.26 g/L。虽然5代菌株的产酸和产酒精能力存在微小差距，产酸能力都维持在2.2 g/L左右且挥发酸含量在0.33 g/L左右，产酒精能力都维持在12%vol以上。由此可以表明，突变菌株Y6-8的高产酸和酒精性能可以稳定的遗传。

图3 Y6-8连续5代产酒精和产酸情况

3 结论

本研究以葡萄表面筛选出的酿酒酵母菌株Y6为出发菌，通过单因素试验确定ARTP处理时间的最佳时间。通过TTC培养基试验、溴甲酚绿培养基试验以及杜氏小管试验对突变菌株进行初步筛选，最后再经葡萄汁发酵试验和遗传稳定性试验确定目标菌株为Y6-8，该突变菌株的产酸能力和产酒精能力较出发菌株Y6分别提高了214.93%和28.13%，该菌株在一定程度上可以解决新疆葡萄酒糖高酸低的现状，提高新疆葡萄酒品质。同时说明ARTP诱变能够高效率改变菌株的发酵性能。但该研究仅将诱变菌株Y6-8在红葡萄酒发酵过程中给予验证，在白葡萄酒的生产中还有待进一步验证。