李雪垠，武懿茂，张凤洁

（1.山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801；2.山西农业大学农学院，山西太谷030801）

谷子（Setaria italica）和狗尾草（Setaria viridis）都属于禾本科狗尾草属一年生草本植物，都是二倍体生物（2n＝18），谷子和狗尾草的基因组测序工作已于2012 年完成[1-2]。谷子，俗称“小米”，是我国北方常见的杂粮作物[3]，小米不仅可食用，还可入药[4]，是孕产妇和婴幼儿的传统营养佳品。近年来，随着其营养价值和药用价值逐渐被大众所认识，小米的市场需求呈增长趋势，关于谷子的基础研究也逐渐引起植物科学家的关注。狗尾草是田间极其常见的杂草，由于其具有基因组小、生长周期短、植株体积小等特点，具有模式生物所应该具有的很多特征，所以，近年来越来越多的植物科学家将狗尾草当作禾本科作物的模式生物来研究。

转录因子是植物中一类非常重要的调控蛋白质，能够调控植物的生长发育与逆境胁迫应答反应，其功能涉及植物发育的几乎所有过程。植物转录因子家族鉴定与分析是研究植物生长发育的基础与前提。WUSCHEL（WUS）-related homeobox（WOX）转录因子基因家族为植物所特有[5]，WOX 基因家族成员在植物的胚胎发育、干细胞维持和器官形成等关键发育过程中发挥着关键性的作用[6]。WOX 转录因子都含有一个由60 个氨基酸组成的非常保守的DNA 结合同源结构域（homeodomain，HD）[5]。同源结构域对于WOX 转录因子功能的发挥起着非常关键的作用[7]。

目前，随着很多植物物种基因组测序工作的完成，植物中越来越多的WOX 基因家族成员已经被鉴定。研究者从陆地棉、毛果杨、鹰嘴豆、小桐子、葡萄和毛竹基因组中已分别鉴定出37，18，17，12，10，5 个WOX 转录因子基因[5，8-11]。WOX 转录因子基因家族的鉴定与分析是进一步研究WOX 基因功能和明确其在植物生长发育过程中作用的重要基础。谷子和狗尾草作为禾本科狗尾草属的2 种主要物种，其基础和相关应用研究已经引起全球植物科学家的广泛重视，但是截至目前，关于狗尾草属WOX 基因家族的鉴定尚未见报道。

本研究拟对谷子和狗尾草2 种常见狗尾草属植物物种的WOX 转录因子家族成员进行全基因组鉴定，并进行系统进化、基因结构、蛋白质基序、顺式作用调控元件和基因表达分析，以期为谷子和狗尾草WOX 家族基因的克隆和功能解析奠定一定的理论基础。

1 材料和方法

1.1 谷子和狗尾草WOX 转录因子家族基因鉴定及蛋白质理化性质分析

基于PlantTFDB V4.0 数据库（http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）[12]，鉴定谷子和狗尾草WOX 基因家族成员。谷子和狗尾草WOX 基因家族成员的编码区和蛋白质序列来源于Phytozome 数据库（V12，https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）。 利 用ExPASy-Compute pI/Mw 工 具（https://web.expasy.org/compute_pi/），分析谷子和狗尾草WOX 基因的蛋白质序列的等电点和分子质量。

1.2 谷子和狗尾草WOX 基因系统发育及基因结构分析

以Cluatal X2 软件[13]对谷子和狗尾草WOX 基因的蛋白质序列进行多重序列比对，并在MEGA 5.0 软件[14]中以Neighbor-Joining 方法构建系统发育树（Bootstrap replications 数目设置为1 000）。以GSDS 2.0 工具（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）[15]对谷子和狗尾草WOX 基因的基因结构进行分析。

1.3 谷子和狗尾草WOX 基因的蛋白质基序和顺式作用调控元件分析

以Multiple Em for Motif Elicitation（MEME，Version 5.0.3，http://meme-suite.org/tools/meme）[16]工具鉴定谷子和狗尾草WOX 基因的蛋白质基序。以PlantCARE（Plant Cis-Acting Regulatory Elements，http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）[17]工具鉴定谷子和狗尾草WOX 基因5′UTR 上游1.5 kb 启动子区域内的顺式作用调控元件。

1.4 谷子和狗尾草WOX 基因组织特异与环境诱导表达分析

从Phytozome 数据库中下载谷子和狗尾草WOX 基因的表达数据，并在R 语言环境下以pheatmap 包分析上述基因表达数据，并制作基因表达热图。

2 结果与分析

2.1 谷子和狗尾草WOX 转录因子家族基因鉴定与蛋白质理化性质

基于植物转录因子数据库PlantTFDB，谷子基因组共有13 个WOX 转录因子基因，狗尾草基因组共有12 个WOX 转录因子基因。根据它们在谷子或狗尾草染色体上的定位情况，将其分别依次命名为SiWOX1～13 和SvWOX1～12。将这25 个WOX 基因的染色体定位、基因组位置、编码区序列长度、蛋白质序列长度、等电点和分子质量等信息进行整理（表1）。由表1 可知，谷子和狗尾草的WOX 基因分布在各自的2，3，5，6，7，8，9 号7 条染色体上，在谷子和狗尾草的1，4 号染色体上没有发现WOX 基因，谷子和狗尾草WOX 转录因子基因的染色体分布情况很相似，这与谷子和狗尾草属近缘物种的事实是一致的。而且WOX 基因在谷子和狗尾草的5 号染色体上分布最多，分别都有4 个WOX 基因。

2.2 谷子和狗尾草WOX 转录因子系统进化关系和基因结构

谷子和狗尾草WOX 转录因子系统进化树如图1 所示。谷子和狗尾草各有13，12 个WOX 转录因子家族成员。从图1 可以看出，谷子和狗尾草的WOX基因在系统进化树中都是成对出现的，如SiWOX1/SvWOX1 等，每对基因（1 个SiWOX 和1 个SvWOX）亲缘关系非常近，它们很可能是直系同源基因，即很可能产生于谷子和狗尾草物种分化前的同一个祖先基因，同时这也充分证明了谷子和狗尾草的亲缘关系非常近，它们是狗尾草属的2 个近缘物种。

从谷子和狗尾草WOX 基因结构（图1）可以看出，SiWOX/SvWOX 同源基因对的基因结构非常相近，即外显子数目和外显子长度很相似。另外，SiWOX 和SvWOX 基因的内含子相位是0 或1，没有相位为2 的内含子。

表1 谷子和狗尾草WOX 基因基本信息及蛋白质理化性质

2.3 谷子和狗尾草WOX 转录因子蛋白质基序

谷子和狗尾草WOX 转录因子蛋白质基序分析结果如图2 所示。谷子和狗尾草WOX 蛋白质共有15 个基序，分别为Motif 1～Motif 15，其中，Motif 1，Motif 3 在谷子和狗尾草所有WOX 蛋白质序列中都有分布，说明Motif 1，Motif 3 在所有蛋白质基序中最为保守。Motif 4 和Motif 5 分别存在于18 个谷子和21 个狗尾草WOX 蛋白质序列中，说明Motif 4 和Motif5 也相对较为保守。蛋白质基序Motif 1，Motif 3，Motif 4 和Motif 5 的保守性可能与WOX 基因功能的正常发挥密切相关。谷子和狗尾草的直系同源基因对（如SiWOX5/SvWOX5，SiWOX4/SvWOX4，SiWOX9/SvWOX9，SiWOX13/SvWOX12 等）不仅亲缘关系较近（图1），而且蛋白质基序也很类似（图2）。

2.4 谷子和狗尾草WOX 基因顺式作用调控元件

WOX 转录因子与植物干细胞维持、胚胎发育和器官形成密切相关[6]，为了探究谷子和狗尾草WOX转录因子与植物生长发育的关系，本研究分析了谷子和狗尾草WOX 基因启动子区域内的顺式作用调控元件，结果列于表2，3。值得注意的是，AACA_motif 和GCN4_motif 元件与胚乳发育有关，CAT-box元件与分生组织形成有关，RY-element 元件功能涉及种子发育（表3）。由表2 可知，SiWOX1，SiWOX4，SiWOX5，SiWOX12，SvWOX1，SvWOX4 和SvWOX5基因的启动子至少包含上述2 种顺式作用调控元件，说明这些基因作为WOX 转录因子家族成员，很可能与胚乳或种子发育、或分生组织形成密切相关。

表2 谷子和狗尾草WOX 基因启动子顺式作用调控元件

2.5 谷子和狗尾草WOX 基因在不同组织和不同环境诱导条件的表达分析

为了进一步探究谷子和狗尾草WOX 基因的功能，本研究分析了谷子和狗尾草WOX 转录因子家族21 个WOX 基因的表达数据，结果如图3 所示。从图3 可以看出，SiWOX6，SvWOX6，SiWOX11 和SvWOX10 在谷子根中表达量较高，在其他组织中表达量相对较低，尤其是SiWOX11 和SvWOX10 这2 个基因在光照处理10 d 的根组织中表达量非常高，说明这4 个基因可能参与调控根系的发育，这与先前WOX 基因与器官发育密切相关的研究结论[6]是一致的。另外，直系同源基因对SiWOX6 和SvWOX6 的基因表达模式也比较相似（图3），这可能与二者启动子区域顺式作用调控元件的种类和数量比较相似（表2）有关。

表3 谷子和狗尾草WOX 基因启动子顺式作用调控元件核心序列及功能

3 结论与讨论

狗尾草属是一年生或多年生禾本科草本植物，主要包括谷子和狗尾草等。谷子耐旱、耐贫瘠，在过去一直被当作主粮和救灾作物，后来由于产量过低，其主粮地位逐渐被水稻、小麦所取代，被归为小杂粮一类，但是时至今日，小米仍然是我国北方重要的功能食品，是滋养肠胃和孕妇催奶的绝佳食品。近年来，谷子被当作水分、氮磷养分高效利用研究的模式生物，又由于其属C4 植物，所以，其也是研究C4 高效光合作用机制非常合适的植物物种。狗尾草是田间常见杂草，经常困扰农民朋友们，但是近年来发现其具有诸多模式生物所应有的特点，其基础研究逐渐引起植物学家们的关注。

植物转录因子种类和数量繁多，大多数转录因子参与植物生长发育或胁迫应答反应等，其功能和作用机制非常复杂，其研究一直是植物领域的热点。研究表明，WOX 转录因子主要参与调控植物器官发育、干细胞维持和胚胎发育等过程[6]。本研究鉴定了谷子和狗尾草的WOX 转录因子家族成员，并进行了生物信息学分析。结果显示，谷子和狗尾草WOX 转录因子基因亲缘关系非常近，无论在基因结构还是在蛋白质基序上都具有极强的相似性，这与谷子和狗尾草是狗尾草属近缘物种的事实是一致的，谷子和狗尾草物种分化的时间可能比较晚，所以，无论是在植株形态还是基因组序列上，都具有很强的相似性。

本研究中顺式作用调控元件分析显示，Si－WOX1，SiWOX4，SiWOX5，SiWOX12，SvWOX1，Sv－WOX4 和SvWOX5 基因的启动子含有AACA_motif，CAT-box，GCN4_motif，RY-element 等元件，表明这些基因很可能与分生组织形成或胚乳、种子发育有关，其具体功能有待后续进一步验证。从本研究基因表达分析可以看出，SiWOX11 和SvWOX10 这2 个基因在根组织中表达量非常高，它们可能与根系发育密切相关。另外，直系同源基因尽管序列非常相似，但是其在特定组织中基因表达情况可能截然相反，比如直系同源基因SiWOX6 和SvWOX6 在幼苗中的表达量差异很大，其调控机制有待进一步研究。本研究利用生物信息学方法鉴定并分析了谷子和狗尾草WOX 转录因子家族基因，为后续狗尾草属植物生长发育相关WOX 基因的克隆和功能研究奠定了理论基础。