洪永刚 郑浩 刘启志 郝立强△

(1.海军军医大学第一附属医院，上海 200433 ；2.海军军医大学第三附属医院，上海 200433)

结肠癌(colorectal cancer，CRC)又称结直肠癌、直肠癌或肠癌，是2015年全球男性第三大常见癌症，女性第二大常见癌症[1]。miRNAs是一类非编码小单链RNAs，其长度在18到25个核苷酸之间，它通过结合靶定mRNAs 3的非编码区(UTR)的特定位点来调节基因表达。miRNAs参与多种细胞和病理过程，包括调控细胞增殖、分化和凋亡。miRNAs还参与肿瘤的形成和包括结直肠癌在内的多种恶性肿瘤的发展[3]。人们越来越清楚的认识到，miRNA在多种癌症中异常表达，且与肿瘤细胞迁移和侵袭有关，并可能在结肠癌的发生和进程中发挥重要作用[4-7]。本实验旨在寻找miR-324-5p在结肠癌中表达水平和探索下游靶基因，为结肠癌的治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 人结肠癌细胞系HCT116和SW620均由中国科学院上海生命科学院细胞库提供；16对结肠癌组织和癌旁正常组织由海军军医大学第一附属医院普外二科提供并经过病理学鉴定；转染试剂LipofactamineTM2000购买于美国Invitrogen公司；miR-324-5p mimic购买于上海吉玛技术制药有限公司。

1.2 方法

1．2．1 细胞培养 HCT116和SW620均在含有10%胎牛血清的DMEM培养液中培养，并含有1%抗生素(链霉素和青霉素)。放置在含有5% CO2的37 ℃孵箱内。

1．2．2 EGFP荧光报告载体实验 第一天将细胞种在24孔培养板中(5x10/孔)，待第二天细胞密度呈70%左右时，按照LipofactamineTM2000说明书对细胞进行转染。细胞同时转染miR-324-5p mimic和含有ABL2 3’UTR的荧光报告载体以及对照质粒。转染48 h后，用1xPBS清洗细胞，然后用RIPA裂解细胞，提取蛋白，最后用荧光光度仪(日立)进行荧光值的测量，以EGFP转染作为内参。

1．2．3 RNA提取和实时荧光定量PCR(real timePCR)RNA的提取按照Trizol说明书进行。对于miRNA的逆转录反应(RT)，用特异的miR-324-5p的RT反应，而对于cDNA的逆转录反应，利用OligodT作为通用引物。对于Real-time PCR反应体系，遵循以下流程：cDNA 1μL、Primers各 1 μL，SYBR 2荧光染料10 μL，无菌蒸馏水7 μL。反应程序为95 ℃变性5 min，然后是95 ℃，15 s、58 ℃ ，30 s，72 ℃ 30 s，进行40个循环(试剂购自Takara公司，PCR仪器是Bio-Rad系统)。

1．2．4 Western blot 第1天将细胞种在6孔培养板中(30×104/孔)，待第2天细胞密度呈70%左右时，按照LipofactamineTM2000说明书对细胞进行转染。转染48 h后，利用RIPA裂解细胞提取蛋白，利用BCA蛋白测定法进行蛋白浓度测定，最后将30 μg蛋白进行上样，利用SDS-PAGE胶进行western blot。ABL2的抗体(抗兔的多克隆抗体)购自美国Abcam公司，二抗是羊抗兔的单克隆抗体。GAPDH作为内参。

1．2．5 体外迁移和侵袭试验 通过使用含有插入物的24孔板(8-μm孔；Costar，美国)对迁移进行分析。同样，通过使用涂有基质的插入物(Costar，美国)进行侵袭测定。下室充满含有12 %血清的600 μL培养基，上腔装有悬浮在200 μL无血清培养基中的2×104细胞。孵育24 h后，侵入到插入物底部的细胞被固定、染色、拍照，并通过在五个随机视野中计数来定量。

2 结 果

2．1 Real time PCR检测结肠癌组织和癌旁组织中miR-324-5p的表达结果 用RT-PCR方法研究人类结肠癌组织中miR-324-5p的水平结果显示，与16例结肠癌癌旁组织相比，16例人类结肠癌组织中miR-324-5p表达水平显著降低(图1)。

图1 十六对结肠癌组织和癌旁正常组织 miR-324-5p 的表达

2．2 细胞迁移侵袭实验检测miR-324-5p对结肠癌细胞侵袭和迁移的影响 在肿瘤转移的过程中，细胞的侵袭和迁移发挥至关重要作用。为了评估miR-324-5p是否是细胞侵袭和迁移的重要因素， HCT116和SW620细胞内转染miR-324-5p mimic后，用Transwell试验检测细胞的迁移侵袭能力。结果显示，miR-324-5p mimic 组的细胞迁移侵袭能力较对照组明显下降(图2，A～D)。

2．3 ABL2是miR-324-5p的靶基因 通过Targetscan对miR-324-5p的靶基因进行预测，结果显示在ABL2的3’UTR上含有miR-324-5p的结合位点(图3)。为了验证预测的准确性，我们的实验研究中构建了含有ABL2与miR-324-5p结合位点序列及其结合位点突变序列的EGFP报告载体(图4A)。结果表明，miR-324-5p模拟物的共转染显著降低了 HCT116和SW620细胞中含有野生型而非突变型ABL2的3’-UTR的荧光素酶质粒的活性(P<0.001)(图4B、4C).此外，qRT-PCR 和Western blot分析显示，与模拟对照组相比，HCT116和SW620细胞中miR-324-5p模拟物的转染在mRNA (P<0.01)和蛋白质水平(P<0.05)上均显著抑制了ABL2的表达(图4D、4E)。

注：**P<0.01。

图2 miR-324-5p在结肠癌细胞系HCT116和SW620细胞迁移和侵袭能力的影响

图3 Targetscan软件预测ABL2为miR-324-5p靶基因

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图4 miR-324-5p直接靶定并且调控靶基因ABL2的表达

2.4 实验检测ABL2对结肠癌细胞侵袭和迁移的影响 对结肠癌组织和癌旁正常组织进行ABL2的实时荧光定量PCR检测，结果表明ABL2在结肠癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织(图5A)。HCT116和SW620细胞转染干扰ABL2的质粒后，Transwell实验显示结肠癌细胞的迁移侵袭能力明显下降(P<0．001)(图5B、5C)。

注：***P<0.001。

图5 ABL2在结肠癌细胞中的表达及对结肠癌迁移侵袭能力的影响

3 讨 论

在本研究中，我们检测了miR-324-5p在人类结肠癌中的表达量和分子机制。发现与相邻的结肠癌癌旁组织相比，miR-324-5p在人类结肠癌组织中的表达被下调了。这些结果表明，miR-324-5p在人类结肠癌中的角色是肿瘤抑制因子。利用体外功能实验来评估miR-324-5p在结肠癌细胞系HCT116和SW620细胞中对侵袭和转移能力的影响。发现miR-324-5p mimic组的细胞迁移侵袭能力较对照组明显下降，从而证实了miR-324-5p对结肠癌侵袭和转移有抑制作用。

有研究显示，ABL2是乳腺癌和前列腺癌的致癌基因[8-9]。然而，目前还没有表明miR-324-5p和ABL2在调节人类结肠癌方面的作用的直接证据。在本研究中，我们试图探讨miR-324-5p对结肠癌中的ABL2的可能调控，结果发现在HCT116和SW620细胞中，上调miR-324-5p能直接下调ABL2的基因mRNA和蛋白质水平。最重要的是siRNA介导的ABL2下调与miR-324-5p上调对于结肠癌的移徙具有相似的肿瘤抑制作用。因此，我们的研究表明，miR-324-5p和ABL2的反馈回路可能在调节人类结肠癌方面发挥重要作用。

目前对于结肠癌的发生发展机制，尽管提出了多种理论解释，但是这种疾病的确切发生机制仍未完全阐明。所以寻找结肠癌新的诊断标志物具有重要意义。本文结果表明，miR-324-5p在结肠癌细胞的迁移转移中起着重要作用，miR-324-5p 通过抑制ABL2 的作用而抑制结肠癌细胞的迁移和转移，这一结果为寻找结肠癌的致病因素提供了新的分子机制，并且为探索治疗结肠癌新的分子标记物提供了新的策略。