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新疆、内蒙古地区马乳及发酵酸马乳中氨基酸分析与营养评价

2019-06-14郭琳仪孙慧阳王海燕吴小勇朱林生葛武鹏

乳业科学与技术 2019年2期
关键词:水解氨基酸内蒙古

郭琳仪,孙慧阳,马 洁,王海燕,吴小勇,朱林生,耿 炜,葛武鹏,*

(1.西北农林科技大学食品科学与工程学院,陕西 杨凌 712100;2.咸阳市食品药品检测检验中心,陕西 咸阳 712000;3.陕西飞天乳业有限公司,陕西 宝鸡 721100;4.咸阳市产品质量监督检验所,陕西 咸阳 712000)

乳是一种生理和营养均衡的乳腺分泌物,通过乳腺中血液的合成及扩散过程形成,具有较高的热值[1],含有人体所需的多种营养素。近年来,人们对乳品的营养要求越来越高,马乳因特色鲜明、营养丰富、资源稀有渐受青睐。

刘亚东等[2]研究发现,马乳可能具有更高的营养价值和更合理的氨基酸模式,且相对于其他乳制品,马乳制品一些结构和功能上的特性使其更符合人们的营养需要,马乳制品的乳糖含量高于其他乳制品,更利于肠道微生物的生长,改善肠道问题[3]。马乳营养组成与人乳非常接近[4],马乳中含有约40%的乳清蛋白,比人乳约高50%,富含必需氨基酸(essential amino acid,EAA)。由于磷脂含量高,马乳对慢性肝炎和胃溃疡的治疗比牛乳更有效,马乳还可以治疗贫血、肾炎、痢疾等疾病,有助于术后康复[5]。酸马乳是牧民以鲜马乳为原料,采用传统发酵过程,经乳酸菌和酵母菌共同自然发酵酿制而成,酸马乳具有独特的风味和口感。发酵过程中添加的配料及微生物代谢产物,如肽类、杀菌物质、维生素、n-3系列脂肪酸、有机酸、CO2、乙醇、芳香物质和大量活性物质会刺激免疫系统,增强抗菌活性[6],因此酸马乳更具营养与保健价值。

马子红等[7]提出,人民生活水平不断提升的同时,我国乳制品产业步入快速发展阶段,呈现出生产规模不断扩大、产品类型日益多样、市场结构趋于稳定等特征。新疆、内蒙古是我国多民族聚居地和养马大省,马乳资源丰富。维吾尔族、哈萨克族、蒙古族等少数民族居民素有饮用马乳和酸马乳的传统。马乳及酸马乳是牧民摄取营养的主要来源之一,并且由于其独特的品质和功能,马乳在辅助疾病治疗及应用于食品行业方面具有巨大潜力。但是,由于受到经济条件、传统观念、地域条件和生产水平等因素的制约,当前对马乳及传统发酵酸马乳的相关营养价值研究与开发一直未得到重视,此类天然绿色乳品的开发利用仍处于初级阶段。

本研究对新疆和内蒙古主产区的马乳及酸马乳中的氨基酸组成进行差异性分析。依据联合国粮农组织/世界卫生组织(United Nations Food Agriculture Organization/World Health Organization,FAO/WHO)提出的氨基酸评分模式和全鸡蛋蛋白模式,计算氨基酸评分(amino acid scoring,AAS)、化学评分(chemical score,CS)和必需氨基酸指数(essential amino acid index,EAAI),评价新疆、内蒙古两地马乳及酸马乳的蛋白质营养价值,探讨地域、发酵因素对马乳中氨基酸含量的影响,为马乳制品的开发与利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品来源

2016年8月,在新疆、内蒙古代表性地区采集乳样共40 份。其中,新疆牧区鲜马乳10 份,酸马乳10 份,内蒙古牧区鲜马乳10 份,酸马乳10 份。人工采集乳样后,装入干净的取样瓶中,密封并用干冰迅速冷却,在冰盒内4 ℃冷藏运至实验室,冻藏于-80 ℃冰箱备用。

1.1.2 试剂

17 种氨基酸标准混合物、氨基酸补充剂盒 美国安捷伦科技有限公司;邻苯二甲醛(o-phthaldialdehyde,OPA)、9-芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl)、3-巯基丙酸、1-辛醇、重蒸苯酚、氢氧化钠、硼酸、十二水合磷酸氢二钠、磷酸(均为分析纯) 美国Sigma-Aldrich公司;乙腈、甲醇(均为色谱纯) 美国Tedia公司;浓盐酸(分析纯) 西安化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

S-433D氨基酸全自动分析仪、LCAK06/Na磺酸基强酸性阳离子交换树脂色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)德国Skykam公司;Aglient 1100高效液相色谱仪、Poroshell HPH-C18色谱柱(4.6 mm×100 mm,2.7 μm)、Poroshell HPH-C18色谱柱保护柱(4.6 mm×5 mm,2.7 μm) 美国安捷伦科技有限公司;HC3018高速离心机 安徽科大中佳有限公司;PB-10 pH计 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;AUY220电子精密天平 日本岛津公司;DHP-140电热恒温干燥箱 中仪国科(北京)科技有限公司;MD200-1氮吹仪 杭州奥盛仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 游离氨基酸的测定

样品前处理:取1 g样品于2 mL离心管,4 ℃条件下以10 000×g离心15 min脱脂,取600 μL上清液,加入200 μL的10 g/100 mL磺基水杨酸水溶液,沉淀蛋白质,静置1 h左右待蛋白质沉淀完全后,4 ℃条件下以10 000×g离心15 min,收集上清液,过0.22 μm滤膜准备上机检测。

色谱条件:色谱柱LCAK06/Na(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相A:柠檬酸钠(0.12 N(当量浓度),pH 3.45);流动相B:柠檬酸钠(0.2 N,pH 10.85);流速:洗脱泵0.45 mL/min,衍生泵0.25 mL/min;检测波长:440 nm(脯氨酸)和570 nm(其余氨基酸);进样量25 μL;梯度洗脱程序如表1所示。

表1 游离氨基酸梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program for free amino acids

1.3.2 16 种水解氨基酸的测定

参照GB/T 5009.124—2016《食品中氨基酸的测定》,并稍做修改。

样品前处理:取乳样200~400 mg(精确至0.000 1 g),置于水解管中,加入10 mL 6 mol/L盐酸,滴加3~4 滴质量分数5%重蒸苯酚溶液,立即放入冷冻剂中冰浴3~5 min,于管口吹氮15 min钳盖封口;水解管温度(110±1) ℃,高温水解22 h,冷却至室温;开管,过滤水解液至50 mL容量瓶,少量多次水洗水解管,转移、定容、混匀;准确吸取1.0 mL滤液至5 mL氮吹管,氮气吹干后,残留物用0.5 mL水溶解,再次吹干,反复2~3 次;最后用1.0 mL水溶解残留样品,过0.22 μm滤膜。

衍生:采用安捷伦液相Poroshell HPH-C18OPA-Fmoc在线衍生程序。

色谱条件:色谱柱Poroshell HPH-C18(4.6 mm×100 mm,2.7 μm);柱温40 ℃,流速1.5 mL/min;流动相A:含10 mmol/L磷酸氢二钠、10 mmol/L硼酸钠的缓冲溶液,用盐酸调pH值至8.2;流动相B:甲醇、乙腈、水体积比45∶45∶10;梯度洗脱程序如表2所示。

表2 水解氨基酸梯度洗脱程序Table 2 Gradient elution program for hydrolyzed amino acids

检测条件:波长338 nm,带宽10 nm,参比390 nm,带宽20 nm(一级氨基酸);波长262 nm,带宽16 nm,参比324 nm,带宽8 nm(二级氨基酸);于赖氨酸出峰后切换波长至262 nm。

1.3.3 色氨酸的测定

参照AOAC 988.15《食品和饲料中色氨酸的测定》,并稍做修改。水解管中加入10 mL脱气的4.2 mol/L NaOH(使用前高纯氮气鼓泡10 min),滴加3 滴1-辛醇,立即置于水解管,于干冰-乙醇浴中冷冻处理,以冻住为宜;充入高纯氮气,于管口吹氮15 min钳盖封口;降至室温,待样品全部融化,置密封的水解管于烘箱中,(110±1) ℃水解处理20 h,冷却至室温;转移水解液至50 mL烧杯,加入浓盐酸,剧烈搅拌,调节水解液pH值至4.25±0.05;将水解液转移至25 mL容量瓶,少量多次水洗水解管,转移、定容、混匀;转移水解液至50 mL离心管,1 150×g离心20 min;滤纸(Whatman GF/A)过滤上清液,转移滤液至离心管,15 000×g离心10 min;取上清液混匀,过0.22 μm滤膜。衍生与色谱条件同1.3.2节。

1.3.4 氨基酸营养评价方法

根据FAO/WHO在1973年建议的AAS标准模式和全鸡蛋蛋白质的氨基酸模式,分别按照公式(1)~(3)计算AAS、CS和EAAI[8-9]。

式中:aa为被测样品氨基酸含量/(mg/g);AA(FAO/WHO)为FAO/WHO评分标准模式中同种氨基酸含量/(mg/g);AA(EGG)为全鸡蛋蛋白质中同种氨基酸含量/(mg/g);n为比较的必需氨基酸种类;Ai为乳样中必需氨基酸含量/(mg/g);Bi为FAO标准中必需氨基酸含量/(mg/g)。

1.4 数据处理

同一样品连续测定2 次,取平均值。采用Minitab 16.2.3和Excel 2007软件进行统计分析,结果均以平均值±2×标准差表示,采用Fisher法进行多重比较,显著性水平设定为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 马乳及酸马乳氨基酸含量比较

2.1.1 游离氨基酸

表3 新疆、内蒙古地区马乳及酸马乳中游离氨基酸含量Table 3 Free amino acid contents of fresh and fermented mare milk in Xinjiang and Inner Mongolia mg/mL

由表3可知:新疆、内蒙古马乳中均共检出29 种游离氨基酸,总量分别为30.42、72.94 mg/mL;新疆酸马乳共检出32 种游离氨基酸,总量为109.74 mg/mL,内蒙古酸马乳共检出36 种游离氨基酸,总量为199.33 mg/mL;9 种EAA中Lys含量最高,10 种非必需氨基酸(nonessential acid,NEAA)中Asn含量最高,17 种非蛋白质编码氨基酸中磷-丝氨酸(P-Ser)含量最高,P-Ser具有提高老年人记忆、治疗老年痴呆的作用[10]。

新疆、内蒙古两地马乳经发酵后,游离氨基酸含量分别升高79.32、126.39 mg/mL,新疆、内蒙古马乳中Lys含量分别为4.82、5.04 mg/mL,发酵后Lys含量显著升高,分别为22.92、23.88 mg/mL,饮用高含量Lys乳对机体增加体质量和身高具有明显作用[11]。新疆地区马乳中除Thr、Ser、Tau、Orn、Hyp、Cit、3-Mhis、1-Mhis、Abu、Car、Ans外,其余游离氨基酸含量在发酵后显著升高(P<0.05)。内蒙古马乳发酵后除Thr、Met、Tau、Orn、Hylys、1-Mhis、Car、Ans外,其余游离氨基酸含量均显著升高(P<0.05)。新疆、内蒙古马乳经发酵后,GABA、β-丙氨酸(β-Ala)含量均显著升高,GABA可显著提高免疫力,并具有抗氧化、降血压、抗焦虑等功能[12-14],β-丙氨酸(β-Ala)具有抗癌、改善小肠损伤、抗氧化、增强运动能力等功能[15-18],说明发酵过程中微生物在促进蛋白质降解、氨基酸释放的同时,也参与了大量具有活性的特殊氨基酸的生物转化生成过程[19]。

2.1.2 水解氨基酸

表4 新疆、内蒙古地区马乳及酸马乳中水解氨基酸含量Table 4 Hydrolyzed amino acid contents of fresh and fermented mare milk in Xinjiang and Inner Mongolia mg/mL

由表4可知:新疆、内蒙古地区马乳及酸马乳中含量最高的水解氨基酸均为Glu,Glu是谷胱甘肽的前体,是重要细胞组分和递质,在一些传染病中,Glu的供应与死亡率和发病率呈负相关[4];9 种EAA中,含量最高者为Leu,其次为Lys、Val和IIe,这与高玎玲等[20]研究结果一致,Leu有助于睡眠、降低痛感、缓和焦躁及紧张情绪;内蒙古鲜马乳中His、Pro含量显著高于新疆马乳(P<0.05),但TAA无显著差异(P>0.05);内蒙古酸马乳较内蒙古鲜马乳,EAA、TAA、DAA、BCAA含量均升高,但无显著差异(P>0.05);新疆、内蒙古酸马乳的EAA、NEAA、TAA均具有显著差异(P<0.05)。

乳中氨基酸的营养价值不仅与氨基酸含量有关,同时与蛋白质质量密切相关。尽管新疆、内蒙古马乳和酸马乳中氨基酸含量不同,但乳样各氨基酸在TAA中占比整体相近。乳中DAA含量与EAA的变化趋势相同,新疆、内蒙古地区马乳及发酵酸马乳DAA/TAA均大于60%,有利于食用者滋补和增强免疫力[22];两地马乳及发酵酸马乳EAA/TAA接近40%,EAA/NEAA均大于60%,符合FAO/WHO理想蛋白质推荐标准;BCAA/TAA均接近20%,BCAA能更快地分解转化为葡萄糖,防止肌肉损失,促进运动后的肌肉恢复,特别适用于健美运动员[23-24]。以上结果表明,新疆、内蒙古地区马乳及发酵酸马乳为优质蛋白源。

新疆马乳样品主要采自哈密巴里坤县和伊犁伊宁县,来自巴里坤马等优良品种,而内蒙古乳样多来自内蒙马和内蒙改良马[25],遗传基因是乳中氨基酸组分及含量具有差异的主要因素,同时还受到饲养方式、泌乳期、环境等因素的影响[26]。不同地区酸马乳制品中存在着复杂多样的乳酸菌菌群及微生态结构,与发酵时间、采样时间及采样点有关[27]。以上均为新疆、内蒙古地区马乳及酸马乳氨基酸组成及含量产生差异的原因。

2.1.3 呈味氨基酸

表5 新疆、内蒙古地区马乳及酸马乳中呈味氨基酸占总氨基酸百分比Table 5 Taste-active amino acid contents of fresh and fermented mare milk in Xinjiang and Inner Mongolia%

对鲜马乳和酸马乳中鲜味、甜味和芳香族3 类味觉氨基酸[28]进行分析。由表5可知:2 个地区的鲜马乳和酸马乳中富含鲜味氨基酸、甜味氨基酸,其中内蒙古马乳中的鲜味、甜味氨基酸含量分别为32.46%和20.31%,均高于新疆马乳(32.12%和19.36%),但内蒙古马乳中的芳香族氨基酸含量(8.12%)略低于新疆马乳(8.75%),综合分析得到,内蒙古马乳风味更鲜甜;新疆马乳经发酵后甜味氨基酸含量明显升高,且新疆酸马乳呈味氨基酸总含量高于鲜马乳,说明发酵对马乳风味有提升作用。

2.2 马乳及酸马乳的氨基酸营养价值评价

食物蛋白质氨基酸模式与人体氨基酸模式拟合度越大,必需氨基酸利用率越高,蛋白质营养价值越高[29],AAS常用来评价食物的氨基酸实用价值。AAS指待测蛋白质中某一必需氨基酸占WHO/FAO评分模式中相应氨基酸含量的百分比,它反映了食物蛋白质与人体蛋白质构成模式的接近程度。CS用于评价待测蛋白质中某一必需氨基酸的相对含量与标准卵清蛋白中相应必需氨基酸相对含量的接近程度,AAS、CS值越接近1,分别说明与标准模式氨基酸组成、标准鸡蛋蛋白质的组成越接近,营养价值就越高[30]。EAAI反映蛋白质源的必需氨基酸与标准蛋白质必需氨基酸组成的拟合程度[2],乳中氨基酸越接近人体所需氨基酸的比例,其生物学价值越高。

表6 新疆、内蒙古马乳及酸马乳的必需氨基酸组成与不同推荐模式值的比较Table 6 Comparison of essential amino acid composition of fresh and fermented mare milk in Xinjiang and Inner Mongolia with different recommended pattern values%

由表6可知,马乳及酸马乳必需氨基酸种类齐全、含量充足。内蒙古酸马乳除Met+Cys外,其他氨基酸占总氨基酸的质量分数均高于FAO/WHO的推荐值;新疆与内蒙古马乳除Met+Cys外,仅Thr含量略低于FAO/WHO的推荐值;新疆、内蒙古马乳及酸马乳中Leu占总氨基酸的质量分数均高于全鸡蛋蛋白质的氨基酸模式值,新疆马乳、内蒙古马乳、新疆酸马乳中的Trp和新疆马乳、内蒙古酸马乳中的Lys占总氨基酸的质量分数均高于全鸡蛋蛋白质的氨基酸模式值;两地马乳及酸马乳蛋白质中必需氨基酸的含量和模式有一定差别。

由表7可知:新疆、内蒙古马乳及酸马乳的EAAI均大于95,说明两地马乳及酸马乳均为优质蛋白质资源;Met+Cys为新疆、内蒙古马乳及酸马乳的第一限制氨基酸;新疆酸马乳EAAI高于新疆鲜马乳;新疆马乳和内蒙古马乳除Met+Cys、Thr外,其余必需氨基酸的AAS均大于1%,内蒙古酸马乳除Met+Cys外,其余必需氨基酸的AAS均大于1%;新疆酸马乳Leu、Ile、Phe+Tyr、Thr、Trp的AAS、CS评分均高于新疆马乳,内蒙古酸马乳除Leu、Phe+Tyr、Trp外,其他必需氨基酸的AAS、CS评分均高于内蒙古马乳,说明发酵提升了新疆、内蒙古两地马乳的营养价值。

表7 新疆、内蒙古马乳及酸马乳的氨基酸评价Table 7 Amino acid evaluation of fresh and traditional fermented mare milk in Xinjiang and Inner Mongolia

3 结 论

新疆、内蒙古两地马乳及酸马乳中游离和水解氨基酸种类丰富、数量充足。新疆、内蒙古地区马乳中氨基酸总量无显著差异(P>0.05),酸马乳中游离氨基酸含量普遍高于相应鲜马乳,同时发酵过程中生成β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、β-氨基异丁酸、高胱氨酸等具有生理活性的特殊氨基酸;新疆酸马乳较鲜马乳含有更多的甜味氨基酸、芳香族氨基酸,味道更佳;新疆、内蒙古马乳及酸马乳的EAAI均大于95,表明新疆、内蒙古马乳及酸马乳均为优质蛋白质源;新疆酸马乳EAAI高于新疆鲜马乳,内蒙古酸马乳除Leu、Phe+Tyr、Trp外,其他必需氨基酸的AAS、CS评分均高于内蒙古鲜马乳。综上,相比新疆、内蒙古鲜马乳,酸马乳具有更高的营养价值。

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