窦娜，李春晓，王婷，王劲松，王海娟，钱海利，南鹏，张竞尧，李慧，门秀丽#

1华北理工大学基础医学院，河北省慢性疾病重点实验室，唐山市慢性病临床基础研究重点实验室，河北唐山063200

2国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院，北京1000210

国家癌症中心统计数据显示，结直肠癌是导致中国癌症相关死亡的常见恶性肿瘤之一，且发病率逐年上升[1]。2015年，中国新增结直肠癌病例数和病死人数分别为33.1万和15.9万[2]。目前，结直肠癌采取手术治疗为主、放化疗为辅的综合治疗手段[3]。虽然结直肠癌的治疗水平不断提高，但是由于结直肠癌的转移率高达50%～60%，故患者远期预后仍不理想[4]。肿瘤转移相关因子1（metastasis associated 1，MTA1）最初是在乳腺癌细胞中被发现的[5]，在结肠癌等多种肿瘤组织中高表达，与肿瘤转移呈正相关[6-7]。然而，MTA1促进结肠癌转移的机制尚不清楚。为阐明MTA1促进结肠癌转移的潜在机制，本实验室前期将敲除MTA1的结肠癌细胞HCT116及对照细胞进行RNA测序分析，发现细胞角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）在敲除MTA1的HCT116细胞中表达显著下调。CK19是细胞角蛋白家族中的一员，当上皮细胞生物学行为发生改变时，其表达水平、细胞定位或翻译后修饰发生改变[8]。已有研究表明，CK19在结直肠癌组织中高表达，且与结直肠癌转移、预后等相关[9]，但未见MTA1与CK19关系的报道。本研究旨在探讨MTA1与CK19在结肠癌细胞中表达的相关性及与结肠癌转移的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2012年8月至2016年6月在中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院行结肠癌切除手术的80例结肠癌患者，所有患者均经过病理组织学检查确诊为结肠癌，同时取结肠癌组织与癌旁组织（距结肠癌组织1～2 cm）进行研究。

1.2 细胞及主要试剂

人结肠癌HCT116细胞、敲除MTA1的HCT116细胞（HCT116crMTA1）、对照细胞（HCT116crMTA1control 2）及人胚肾293细胞由中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院国家重点实验室保存。慢病毒空载（Lenti-GFP）、过表达MTA1慢病毒（Lenti-MTA1）、无意义的小干扰RNA（siNC）、CK19特异性的小干扰RNA（siCK19）均购自上海吉玛制药技术有限公司，CK19过表达质粒与CK19过表达对照质粒均购自广州复能基因有限公司，psPAX2、pMD2.G均购自北京中原合聚经贸有限公司，嘌呤霉素购自生工生物工程（上海）股份有限公司，Lipofectamine 2000购自英潍捷基（上海）贸易有限公司，Matrigel基质胶购自北京市普京康利科技有限公司，兔抗人MTA1购自艾博抗（上海）贸易有限公司，鼠抗人β-actin、CK19抗体分别购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司、美国Santa Cruz Biotechnology公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔及羊抗鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、SP试剂盒、PV-9001试剂盒及二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 免疫组织化学染色结果判定

由经验丰富的高年资病理医师对染色结果进行评价，每例组织标本分别独立评价至少5个高倍视野，且每个视野观察细胞数不少于200个。结合染色强度和染色细胞所占百分比评分进行结果判定。染色强度：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色为3分；染色细胞所占百分比：无染色细胞为0分，＜10%为1分，10%～50%为2分，51%～80%为3分，＞80%为4分。两项评分的乘积即为MTA1或CK19蛋白表达的最终评分，评分＞4分为MTA1或CK19蛋白高表达，评分≤4分为MTA1或CK19蛋白低表达。

1.4 细胞系的构建

接种对数生长期的HCT116细胞，培养过夜，待其融合度达30%时分别加入10 μl Lenti-MTA1和Lenti-GFP，继续培养48 h后加入嘌呤霉素筛选，分别构建MTA1过表达结肠癌HCT116细胞系（HCT116MTA1）和对照细胞系（HCT116control 1）。按照1.5∶1∶2的比例将包装质粒psPAX2、pMD2.G和目的质粒转染至人胚肾293细胞中（两组目的质粒分别是CK19过表达质粒、CK19过表达对照质粒），48、72 h后收集病毒，-80℃保存。待HCT116crMTA1细胞融合度达30%～50%时，加入病毒，隔天换病毒，分别构建CK19过表达细胞系（命名为HCT116crMTA1CK19组）和CK19过表达对照细胞系（命名为HCT116crMTA1control组）。

1.5 RNA干扰实验

对HCT116MTA1细胞分别转染siCK19和siNC，构建敲降CK19细胞系及敲降CK19对照细胞系，命名为HCT116MTA1siCK19组和HCT116MTA1-control组，按照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书进行转染。

1.6 蛋白质印迹法（Westernblot）检测蛋白表达情况

收集细胞，提取蛋白质，以10%的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离蛋白，恒压15 V转膜90 min，5%脱脂牛奶封闭1 h，加入一抗 MTA1（1∶1000）、CK19（1∶1000）、β-actin（1∶5000），4℃孵育过夜，用含0.1%吐温-20的磷酸盐 缓 冲 液（Tween-20 phosphate buffered saline，PBST）洗膜3次，加入二抗IgG（1∶5000），常温孵育1 h。PBST缓冲液洗膜3次，曝光、显影。

1.7 细胞侵袭实验

将Matrigel基质胶均匀包被Transwell小室的上室基底膜，置于培养箱中1 h，之后将100 μl细胞悬液加入上层小室中，下室加入600 μl 20%血清培养基，培养48 h后，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗3次，甲醇固定约10 min，结晶紫溶液染色10 min，倒置显微镜下随机选取5个视野计数并拍照，实验重复3次，取平均值。

1.8 共表达基因分析

对TCGA-COAD数据集中的结直肠癌组织的质谱数据进行基因共表达分析，利用cBioPortal软件分析平台，获取结直肠癌在TCGA数据库中的质谱数据，筛选共表达的基因，筛选条件为：Spearman相关系数绝对值＞0.3，P＜0.05，筛选MTA1和CK19共表达的基因集，求取交集后，利用DAVID数据库进行GO富集分析，找出显著富集的功能聚类项。

1.9 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，采用Pearson相关分析法进行相关性分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTA 1、CK19的表达及相关性分析

采用免疫组织化学法检测80例结肠癌组织及80例癌旁组织中MTA1及CK19的表达情况。结果显示在结肠癌组织中，MTA1在细胞核及细胞质中均有表达，其中MTA1低表达9例，高表达71例；CK19主要在细胞质中表达，其中CK19低表达40例，高表达40例。而在癌旁组织中，MTA1、CK19均低表达。结肠癌组织中MTA1、CK19评分均明显高于癌旁组织，差异均有统计学意义（P＜0.01）（表1）。Pearson相关分析结果显示，在结肠癌组织中MTA1与CK19表达呈显著正相关（r=0.490，P＜0.01）。

表1 结肠癌组织与癌旁组织中MTA 1与CK19评分的比较（± s）

表1 结肠癌组织与癌旁组织中MTA 1与CK19评分的比较（± s）

组织类型结肠癌组织（n=80）癌旁组织（n=80）t值P值MTA1评分7.53±2.41 1.21±1.08 21.411 0.000 CK19评分4.79±2.47 0.36±0.64 15.518 0.000

2.2 HCT116MTA 1、HCT116crMTA 1细 胞 中 的CK19表达情况

在MTA1过表达的HCT116MTA1细胞中CK19表达上调，而在敲除MTA1的HCT116crMTA1细胞中CK19表达下调。（图1）

2.3 MTA 1、CK19对结肠癌细胞侵袭能力的影响

图1 Westernblot法检测四组细胞中MTA 1与CK19的表达情况

Transwell侵袭实验结果显示，HCT116crMTA1control组细胞穿透细胞数为（58.33±16.07），少于HCT116crMTA1CK19组的（147.00±10.82），差异有统计学意义（t=4.604，P＜0.05）；HCT116MTA1-control组细胞穿透细胞数为（1077.67±233.98），多于HCT116MTA1siCK19组的（671.33±78.04），差异有统计学意义（t=-2.853，P＜0.05）。

2.4 MTA 1、CK19共表达基因分析

通过TCGA数据库，分别筛选得到在结直肠癌中与MTA1及CK19表达相关的基因集，然后对上述两个基因集求取交集，进行功能聚类分析。共筛选获得与MTA1表达相关的基因2675个，与CK19表达相关的基因3674个，其中重叠基因2315个。利用DAVID数据分析平台对上述重叠基因集进行基因功能聚类分析，发现该基因簇参与细胞黏附、mRNA剪接、细胞代谢、蛋白质合成等生物学过程（图2），其中细胞黏附过程的参与基因包括鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β2亚基类似物1（guanine nucleotide binding protein beta polypeptide 2-like 1，GNB2L1）、皮层肌动蛋白（cortactin，CTTN）、α胞衬蛋白 1（spectrin alpha，non-erythrocytic 1，SPTAN1）和淋巴细胞溶质蛋白1（lymphocyte cytosolic protein 1，LCP1）等。

图2 与MTA 1、CK19表达相关的重叠基因的GO聚类分析

3 讨论

结肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，在中国发病率逐年增高[10]。多数患者在明确诊断时已处于癌症晚期，肿瘤转移是导致其高病死率的主要原因[11]。虽然已知结肠癌转移是多基因共同作用的结果，但对结肠癌的转移机制还尚未清楚。开展结肠癌转移机制的研究对延长结肠癌患者生存及改善预后具有重要意义。

肿瘤转移相关因子（metastasis associated，MTA）是与肿瘤转移高度相关的基因家族，在肿瘤组织中高表达，与肿瘤患者的预后密切相关。其中，在多种肿瘤组织中高表达的MTA1基因，是第一个被发现的MTA家族成员[12]。近年来，研究发现MTA1与恶性肿瘤组织的浸润转移密切相关，高表达MTA1的肿瘤组织浸润率和淋巴结转移率明显增高，且更易发生血行转移[13]。MTA1主要参与组成具有核小体重塑活性的组蛋白去乙酰化酶，促进组蛋白脱乙酰基，间接调控抑制肿瘤浸润转移的基因，进而发挥促进肿瘤浸润转移的作用[14]。已有研究表明，MTA1可以通过改变细胞角蛋白的组装，调节细胞骨架蛋白的定位，增强肿瘤细胞的恶性行为，使肿瘤细胞具有更强的侵袭和转移能力。细胞角蛋白参与调节包括细胞迁移、凋亡、侵袭与感染等多个过程[15]。已有研究表明，CK19在结肠癌组织中高表达，且与结肠癌转移、预后等相关[9]。CK19是构成细胞骨架蛋白中间丝的主要成分之一，参与维持上皮结构的稳定[16]。CK19在上皮来源的肿瘤细胞中特异性表达，健康人外周血中无表达，如在肿瘤患者外周血中检测到CK19的表达，则考虑发生血行微转移[17]。本实验室前期的RNA测序结果表明CK19在敲除MTA1的HCT116细胞中表达显著下调，本研究结果显示MTA1蛋白与CK19蛋白在结肠癌组织中表达呈显著正相关。进而，在过表达MTA1的HCT116细胞中应用RNA干扰技术沉默CK19，可减弱肿瘤细胞的侵袭能力；在敲除MTA1的HCT116细胞中过表达CK19，可增强肿瘤细胞的侵袭能力；以上结果表明，结肠癌细胞中MTA1可通过上调CK19增强肿瘤细胞的侵袭能力，这在既往文献中未见报道。此外，为了给后续研究提供线索，本研究通过数据库分析获得与MTA1、CK19表达均相关的基因簇，并进行功能聚类分析，发现与MTA1、CK19表达均相关的基因簇参与细胞黏附、mRNA剪接、细胞代谢、蛋白质合成等过程，其中MTA1参与mRNA剪接与细胞代谢等均已有相关报道，说明该数据分析具有可靠性。同时，MTA1、CK19在细胞黏附过程中的富集分数最高，提示MTA1、CK19可能通过调控细胞黏附过程促进肿瘤细胞的侵袭。具体而言，基因功能富集分析提示，在与MTA1、CK19表达相关的基因簇中，GNB2L1、CTTN、SPTAN1和LCP1等可能参与MTA1、CK19调控的细胞黏附过程。LCP1是高度保守的肌动蛋白结合蛋白，与波形蛋白四聚体形成复合物，在细胞黏附期间参与波形蛋白的组装并构成细胞骨架[18]。同时，LCP1的一个结构域蛋白与波形蛋白相互作用，而另一个结构域蛋白可与CK19相互作用[19]。MTA1、CK19有可能通过与LCP1蛋白的相互作用进一步影响细胞黏附过程，从而影响结肠癌的转移，具体的调控机制还有待进一步验证。

综上所述，在结肠癌组织中，MTA1和CK19表达呈正相关，MTA1可通过上调CK19促进结肠癌HCT116细胞侵袭。MTA1、CK19有可能作为结肠癌转移的标志物，为治疗结肠癌转移提供分子治疗靶点，具体的作用机制有待进一步研究。