莫燕月 唐浩元 何春玫

(广西农业职业技术学院,南宁 530007)

黄连(Coptis chinensis Franch.),毛茛科植物,别名味连、川连,具有抗菌消炎、抗病毒、抗腹泻、解热、降血糖血脂、抗氧化、影响心血管和血液系统、抗溃疡等功效[1,2]。黄连主要含盐酸小檗、黄连碱、巴马汀等原小檗碱型生物碱[3],其中盐酸小檗碱(Berberine hydrochloride)亦称黄连素,是黄连抗菌的主要有效成分,含量可达11.3%[4]。

目前提取盐酸小檗碱的传统方法主要有回流法、索氏连续回流提取法、冷浸法和渗漉法等,这些方法都存在或提取时间太长、或提取率较低、或溶剂使用量大等缺点,近年来发展起来的酶辅助、微波辅助和超声波辅助等提取方法,在一定程度上弥补这些缺点[5]。其中超声波提取技术是利用超声波产生的强烈振动、空化效应、搅拌等作用以加速植物有效成分进入溶剂,提高提取率、缩短提取时间、简化操作步骤、节约实验成本。故本研究拟采用响应面分析法优化超声波辅助提取黄连中盐酸小檗碱工艺,为盐酸小檗碱分离纯化的规模化生产,进一步开发利用黄连药材提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

黄连购自南宁市华泰中药饮片有限责任公司,生产批号170201,产地四川;盐酸小檗碱标准物质,生产批号43240010,上海安谱实验科技股份有限公司;乙醇,分析纯;超纯水(自制)。

1.2 实验设备

V-1800型分光光度计;石英比色皿;KQ-300DB型数控亲水性超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司产);JP-1000B型高速多功能粉碎机;EL204型电子天平;UPT-II-20T型优普系列超纯水机。

1.3 试验方法

1.3.1 盐酸小檗碱标准曲线的绘制 精确称取盐酸小檗碱0.02g,以适量80%乙醇溶解后定容于100mL容量瓶中,准确吸取0、1、2、3、4、5、6mL上述标准液,稀释并定容至25mL,所得盐酸小檗碱系列工作液分别相当于0、2、4、6、8、10、12g/mL盐酸小檗碱标准溶液。在320～400nm波长下对盐酸小檗碱工作液进行扫描,在348nm处出现最大吸收波长。以纯化水为参比,系列工作液吸光度A348为纵坐标、盐酸小檗碱含量C为横坐标绘制标准曲线并拟合回归方程(图1所示)。

图1 盐酸小檗碱标准曲线

1.3.2 盐酸小檗碱的提取工艺和提取率的计算 将黄连药材粉碎为粗粉。精密称量一定质量粗粉于小锥形瓶中,按料液比1∶30(g/mL)加入一定浓度的乙醇,密封后超声处理提取一定时间,过滤,定容。将提取液适当稀释,用石英比色皿测定样品溶液的吸光度A348。

式中：C—盐酸小檗碱浓度(mg/mL);V—定容体积(mL);n—稀释倍数;m—黄连粗粉质量(g)。

1.4 单因素实验

1.4.1 超声时间对盐酸小檗碱提取率的影响 按1.3.2,以料液比1∶30(g/mL)分别加入80%乙醇溶液,在40℃、210W超声波功率下,分别超声处理20、30、40、50min,过滤,定容,再适当稀释后,分别测定样品溶液的吸光度A348,计算盐酸小檗碱提取率。

1.4.2 提取温度对盐酸小檗碱提取率的影响 按1.3.2,以料液比1∶30(g/mL)分别加入80%乙醇溶液,在210W超声波功率下,分别在30、40、50、60℃的温度下超声处理30min,过滤,定容,再适当稀释后,分别测定样品溶液的吸光度A348,计算盐酸小檗碱提取率。

1.4.3 超声波功率对盐酸小檗碱提取率的影响 按1.3.2,以料液比1∶30(g/mL)分别加入80%乙醇溶液,在40℃下以0、180、210、240、270、300W超声处理30min,过滤,定容,再适当稀释后,分别测定样品溶液的吸光度A348,计算盐酸小檗碱提取率。

1.4.4 乙醇浓度对盐酸小檗碱提取率的影响 按1.3.2,以料液比1∶30(g/mL)分别加入60、70、80、90%乙醇溶液,在40℃、210W超声处理30min,过滤,定容,再适当稀释后,分别测定样品溶液的吸光度A348,计算盐酸小檗碱提取率。

1.5 响应面分析

通过单因素试验考察超声时间、超声功率、提取温度和乙醇浓度的影响水平,并筛选出影响盐酸小檗碱提取率较显著的三个因素,利用Design Expert 10.0.4软件进行Box-Behnken响应面优化试验方案设计,响应面试验因素水平表见表1。

表1 Box-Behnken响应面试验因素水平表

1.6 验证优化条件

将Box-Behnken响应面优化试验方案模型拟合得到的最佳工艺条件,进行3次重复性实验,所得结果取均值后,与模型给出的理论数据进行比较,验证模型的可靠性。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 超声时间对盐酸小檗碱提取率的影响 选择乙醇浓度为80%,提取温度为50℃,超声功率240W,超声时间为0、20、30、40、50min提取盐酸小檗碱,计算盐酸小檗碱提取率,结果如图2所示。

图2 超声时间对盐酸小檗碱提取率的影响

由图2可见,黄连中盐酸小檗碱的提取随时间的推移呈现先增大后减小的趋势,当提取时间在0～30min时,植物细胞壁破碎程度加大,更有利于细胞内物质的溶出。超声40min后提取率呈现下降趋势,可能是因为随超声时间的增长细胞破壁程度更细碎,胞内物质析出更多,这些杂质与盐酸小檗碱竞争溶解于乙醇,同时细碎的细胞对盐酸小檗碱也有一定的吸附作用,从而导致盐酸小檗碱提取率呈现下降趋势。因此,超声时间初步确定为30min。

2.1.2 提取温度对盐酸小檗碱提取率的影响 选择乙醇浓度为80%,超声功率240W,超声时间为30min,提取温度为30、40、50、60℃提取盐酸小檗碱,计算盐酸小檗碱提取率,结果如图3所示。

由图3可见,由30℃温度稍低,分子运动速度略慢,有效成份的溶解速度略慢,因此提取率略低。温度升高后,分子运动速度增快,提取率上升并达到最高值。在本实验过程中,室温在20±5℃,且30℃时提取率为最佳温度40℃的92.0%,可见,提取温度的变化对盐酸小檗碱的提取率影响不大且样液经超声处理后温度升高,因此后续实验设置提取初温度为40℃,且不对提取温度因素进行响应面试验。

图3 提取温度对盐酸小檗碱提取率的影响

2.1.3 超声功率对盐酸小檗碱提取率的影响选择乙醇浓度为80%,超声时间为30min,提取温度为40℃,超声功率为0、180、210、240、270、300W提取盐酸小檗碱,计算盐酸小檗碱提取率,结果如图4所示。

图4 超声功率对盐酸小檗碱提取率的影响

由图4可见,在超声功率为0～240W时,随着超声功率增大,黄连粗粉细胞破碎率越大,盐酸小檗碱提取率越大,240W时达到最大提取率,再增大超声功率,提取率略有起伏,但变化不大。因此,超声功率初步确定为240W。

2.1.4 乙醇浓度对盐酸小檗碱提取率的影响 选择超声时间为30min,提取温度为50℃,超声功率为240W,乙醇浓度为60、70、80、90%,提取盐酸小檗碱,计算盐酸小檗碱提取率,结果如图5所示。

由图5可见,乙醇浓度对盐酸小檗碱的提取有影响,实验过程中发现,当乙醇浓度低于60%时,过滤速度很慢,当乙醇浓度大于60%时,提取率呈现先上升后下降的趋势,80%时提取率最高,可能是因为盐酸小檗碱极性与80%乙醇相近,溶解度最高。因此,乙醇浓度初步确定为80%。

图5 乙醇浓度对盐酸小檗碱提取率的影响

2.2 响应面实验结果与分析

根据单因素实验结果发现,4个因素均对黄连中盐酸小檗碱的提取有影响,其中提取温度的较优水平为40℃、超声时间的较优水平为30min、乙醇浓度的较优水平为80%、超声功率的较优水平为240W。选择超声时间、乙醇浓度、超声功率3个因素的3个较优水平,以盐酸小檗碱提取率为响应值,通过Box-Behnken设计响应面试验方案。结果发现在此条件下,乙醇浓度和超声时间两因素间的交互影响极显著,最佳工艺条件为超声功率210W,超声时间40min,乙醇浓度78.2%,其中超声功率和超声时间均达到响应面设计时因素水平的极端值,因此调整因素水平,重新设计响应面试验方案,响应面试验方案与结果见表2。

对表2数据进行回归拟合,可得响应变量A、B、C对提取率(Y)的回归方程为：

Y(%)=8.93-0.26A+0.19B-1.05C+0.080AB+0.020AC-0.43BC-0.64A2-0.31B2-1.21C2

表2 响应面实验设计及结果

利用Design Expert8.0软件对表2数据进行ANOVA方差分析,结果如表3如示。

表3 ANOVA方差分析表

经分析,回归模型的R2=0.9842,=0.9639,P＜0.0001,说明模型拟合度较好,模型可靠;失拟项P=0.8511,影响不显著,说明非试验因素对试验结果影响不大;变异系数C.V.%=2.67＜5,说明该回归模型可信度较高;精密度值=20.38＞4,说明该模型合理,因此,可应用该模型预测和分析黄连中小檗碱提取条件。各因素对黄连中盐酸小檗碱提取率的大小影响顺序为：C(乙醇浓度)＞A(超声功率)＞B(超声时间),其中乙醇浓度和提取功率的影响极显著(P＜0.01),超声时间的影响显著(P＜0.05)。

2.3 各因素间交互作用分析

根据表3方差分析结果可见,影响因素之间B(乙醇浓度)与C(溶液pH)的交互影响极显著(P＜0.01),其他因素之间的交互作用不显著。交互显著项的响应面图和等高线图如图6所示。

图6 两因素交互作用的响应面图和等高线图

由图6可见,B、C两因素的等高线图呈现椭圆形,响应面图呈现马鞍形,表明两者具有显著的交互作用,与ANOVA方差分析结果一致。观察图中可见,沿乙醇浓度方向的曲线密度较大,可见乙醇浓度的变化对盐酸小檗碱的提取率有较大影响,符合ANOVA方差分析结果。

2.4 最优工艺条件验证

经采用Design-Expert10.0.4软件进行数据分析,黄连中盐酸小檗碱提取的最优工艺条件为超声功率204.760W,超声时间46.744min,乙醇浓度74.442%,预测提取率为9.308%。从实际操作条件出发,调整最优提取工艺为超声功率210W,超声时间47min,乙醇浓度75%,平行提取3次,测得盐酸小檗碱提取率为9.10%,与预测值相对误差为-2.23%,说明该工艺条件用于提取黄连中盐酸小檗碱较可靠。

3 结论

本研究以市售黄连为原料,采用超声波辅助乙醇提取法,在单因素实验基础上,通过Box-Behnken设计响应面试验优化提取工艺,实验结果表明,各因素对黄连中盐酸小檗碱提取率的大小影响顺序为：C(乙醇浓度)＞A(超声功率)＞B(超声时间),得到盐酸小檗碱提取的最优工艺条件为超声功率204.760W,超声时间 46.744min,乙醇浓度74.442%,预测提取率为9.308%,为超声波辅助提取黄连中盐酸小檗碱工艺提供一定的科学依据。