何连军 李诗言 赖姝毓 张宜明 庞林江 戴 丹

(杭州职业技术学院1，杭州 310018)

(浙江水产技术推广总站2，杭州 311300)

(浙江农林大学农业与食品科学学院3，杭州 311300)

(浙江农林大学信息工程学院4，杭州 311300)

基质是样品中被分析物以外的物质，对分析物的分析过程有着显著的干扰，并影响分析结果的准确性。近年，针对复杂基质的样品制备和净化技术获得了飞速发展并广泛地应用于食品安全、化学和环境分析领域。固相萃取(Solid phase extraction,SPE)、凝胶色谱(Gel polymer chromatography,GPC)以及快速固相分散萃取(QuEChERS)等新技术在食品安全分析中得到了广泛的应用[1-7]。

粮油食品加工过程中可能涉及到一些非法添加剂加入[8]，如辣椒油中可能会违规添加苏丹红等非人工合成染料色素。一般认为苏丹红I 的浓度在100～1000mg/kg之间才能赋予相应食品应有的颜色[3]。苏丹红I的log P值大约在5.86，这意味着其有着非常高的脂溶性[4]。针对诸如油脂类复杂基质样品，目前国标法检测样品前处理步骤包括旋转蒸发、氧化铝柱层析富集、氮吹浓缩等，但其操作复杂，涉及设备和转移步骤多，溶剂消耗大，流程长易造成组分损失和污染。因此，开发新的快速净化策略并同时达到节约溶剂、环境友好的效果有着科学与实践意义。

薄层色谱(Thin laye chromatography, TLC)作为一种传统的分离方法，在样品分析或制备中获得广泛应用[9]。然而，现有薄层色谱法存在上样量不足、分析方法灵敏度不足等某些缺点。随着液相色谱-质谱方法的普及，仪器分析的灵敏度获得较大提升从而弥补了薄层层析的样品通量不足缺点[10]。本研究选择苏丹红作为油脂类样品食品污染物的模拟底物[11,12]，采用柔性纸基薄层色谱条带建立纸基薄层净化策略，探索纸基薄层净化条带在净化策略的可行性，净化后的辣椒油样品通过液相色谱或串联质谱等设备能灵敏地检测这些化合物，整个过程快速、简便、节省溶剂。本研究针对基质复杂的油脂样品提供了一种净化和痕量残留的检测策略，并有望应用于其他食品安全分析领域。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

硅胶G60作为薄层条带固定相(200～400目)，亮蓝、柠檬黄、日落黄、苏丹红染料标准溶液、聚氯乙烯(PVC)涂布纸；对照固相萃取小柱采用苏丹红专用小柱(ProElut SDH，500mg，6mL，Partnumber：65909)；样品为低油脂含量样品为辣椒粉样品(辣椒油的主要原料之一)，高油脂样品为辣椒油样品。

1.2 仪器与设备

SP-Ⅱ电动点样机，玻璃展开缸(100cm×200cm)，真空抽滤装置，分析天平，均质器，其他辅助仪器包括氮气吹扫器、IKA均质、振动、水浴声波发生器；旋转器蒸发工具，恒温水浴锅；采用12通道手动固相萃取装置；液相色谱-质谱联用及相关色谱柱；分析仪器主要包括ExionLC AD系列液相色谱仪、4500Qtrap三重四级杆质谱仪。

1.3 纸箔薄层色谱板的制备

聚乙烯(PC)涂布纸(A4打印纸尺寸)被用作薄层基材。首先取适量硅胶G60、黏合剂羧甲基纤维素与水混合成为待涂覆固定相，用铁尺刷在涂布纸表面，然后在85℃的烘箱中干燥30min，储存在干燥器中待使用。纸基薄层色谱条带的制备细节可参见之前的工作[13]，可根据试样含油脂量的不同类型，可在纸箔背板上用铅笔标记出特征靶区标记。

1.4 油脂类样品的制备与净化

1.4.1固相萃取净化

固相萃取净化是当前实验室常用的净化手段，针对本研究底物油脂中的苏丹红，固相萃取方案参考采用了目前技术上成熟的迪马科技ProElut SDH固相萃取柱和相关处理程序，并作为TLC净化的常规对照方法。首先称取0.5g辣椒油样品(加标样品在样品中加入不同浓度苏丹红标准溶液)，以10mL乙腈均质搅拌5min，超声提取5min，8000r/min下离心2min，将下层残留物依次用10mL、10mL乙腈按照之前步骤重复提取两次，合并三次上清液。将上清液在40℃水浴条件下减压蒸至近干，再加入5mL正己烷混匀，待净化。辣椒油的主要原料辣椒粉样品则提取过程同前，称量0.5g辣椒粉样品以乙腈提取，最终以5mL正己烷混匀，待净化。

固相萃取净化：5mL正己烷活化柱子后，加入待净化液，弃去流出液。依次加入5mL正己烷，5mL1%乙酸乙酯正己烷，弃去流出液后再加入10mL30%乙酸乙酯正己烷，收集流出液，将洗脱液在40℃下减压蒸馏近干，溶液以乙腈定容1.0mL，供HPLC-MS分析。

1.4.2TLC净化

称取0.5g辣椒油样品，直接用2.0mL正己烷直接稀释0.5g油脂样品，无需乙腈提取步骤。辣椒粉样品则需要与前述提取定容步骤一致，配置成待净化溶液。准确移取50μL样品稀释待净化溶液精确地抽吸到薄层色谱点样器上(加热板温度为50摄氏度)。以条带上样模式将样品自动打印在净化条带(30mm×60mm)的上样区线上，然后将制备好的条带插入展开缸，以正己烷/丙酮/冰乙酸(65∶35∶1)为展开剂进行薄层色谱展开净化。当展开剂的前沿到达该线时，该过程结束，然后取出在平板上干燥。将苏丹红展开目标区约0.5cm宽，整体裁切下转移至细管玻璃试管，加1mL乙腈超声提取2次，合并提取溶液，氮吹至近干，以0.2mL氨化乙腈(2%)复溶后高速离心，上清液转移至内插管的进样瓶中待进样。

1.5 LC-MS/MS分析条件

色谱柱为Phenomenex Kinetex C18(2.1mm×100mm，2.6μm)；流动相A为乙腈，流动相B为5mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%甲酸)；柱温为40℃；流速为0.4mL/min；进样量为2μL。梯度洗脱程序：0～0.5min，60% B；0.5～5.0min，60%～5% B；5.0～7.0min，5% B；7.0～7.1min，5%～60% B；7.1～10min，60% B。离子源为电喷雾离子源，正源模式，离子源温度550℃，电喷雾电压5500V，雾化气(GS1)压力345kPa，辅助气(GS2)压力379kPa，气帘气(CUR)压力172kPa，扫描方式为多反应监测(MRM)模式，具体质谱参数见表1。

表1 目标物化合物的质谱参数

注：* 表示定量离子。

1.6 灵敏度、线性范围以及准确性回收率实验

以空白裁切条带作为基质补偿溶液，配制工作曲线和标准溶剂配制的曲线进行对比，确定灵敏度、线性范围。本研究分别在2、10、200μg/kg的加标水平上对辣椒油样品中的加标样品进行了回收率研究。LC-MS在MRM定量模式下进行用回收实验保证分析结果的准确性。

2 结果与讨论

2.1 纸基薄层条带分离活性的表征

纸基薄层条带在使用之前，需对其分离活性进行表征考查。以STAHL法作为测定薄层条带分离活性的参考方法[14]。采用柠檬黄、亮蓝和日落黄3种染料来指示当前条带的分离活性。从图1中可以观察到3种染料组分的Rf保持恒定，且3种染料化合物被完全分离，说明现有的纸基薄层条带可以有效地分离指示化合物，因此，本试验结果验证了现有的薄层条带保持了高分离活性。

注：a-d依次为亮蓝，日落黄，柠檬黄及其3种混标，5 mg/mL。

2.2 展开溶剂的选择优化

为了消除干扰和基质化合物，将苏丹红4种组分集中收集到目标区，需要选择不同的有机溶剂及配比。由于苏丹红自身颜色，在平面色谱中净化和分离的结果肉眼可见，故展开效果很直观。选择比较了正己烷/乙醚(6∶1)、正己烷/丙酮(65∶35)、氯仿/丙酮(9∶1)等体系，结果表明，正己烷/乙醚(6∶1)体系能有效分离辣椒油提取过程中出现的苏丹红等色素及干扰，但这4种苏丹红化合物分别位于2个不同的Rf位置导致四组分不能集中流出，从而不适合下一步同时裁切4种目标化合物。氯仿/丙酮体系不能有效分离目标化合物和其他干扰。正己烷/丙酮(65∶35)体系提供了较好的分离效果，4种苏丹红化合物集中位于同一位置，比移值约在0.75处，且四组分流出集中，展宽约0.2～0.5mm，有利于下一步裁切。该比移值与王群等[15]的研究结果一致。鉴于乙酸可以有效地降低目标化合物的拖尾效应[16]，在现有的溶剂体系中加入一定量的乙酸，最终优化选择正己烷/丙酮/乙酸(65∶35∶1)体系作为最终优化的展开体系。

2.3 样品的净化制备

固相萃取法是样品制备与净化可靠的方法，但其固相萃取柱的成本和一定的有机溶剂消耗是不可避免的。近年来，快速、低有机溶剂消耗的前处理成为发展新型样品前处理技术的一个主要趋势。一些研究者开始使用自动薄层色谱制备仪器对复杂的样品进行净化[9,10,17]，这说明薄层层析作为样品前处理的一种方法逐渐被主流实验室认可。考虑到辣椒粉中的色素可以明显直观的显示当前待测物苏丹红的分离净化效果，为此，首先测试了辣椒粉中提取物净化分离的效果。图2显示了四组分混合标准溶液、辣椒粉样品空白或加标提取液分别处于点状上样模式和条带上样模式下的TLC分离效果。试验表明4种标准化合物经过展开分离位于条带上宽度仅2mm左右区域，可以清晰观察到4种苏丹红染料的靶区，苏丹红四组分相对比移值Rf均处于0.75处且相当恒定。辣椒粉中红色和黄色色素与苏丹红四种化合物(5.0μg/mL)相比移动明显延迟，证实了当前TLC层析条带对样品组分有效的净化和分离。这些红色和黄色物质根据其颜色和有关紫外检测分析分别是叶黄素和胡萝卜素。

注：a 空白辣椒粉提取物和四组分苏丹红(10 μg/mL)点状点样分离效果；b 加标辣椒粉提取物和四组分苏丹红(10.0 μg/mL以及5.0 μg/mL)；c 空白辣椒粉提取物和四组分苏丹红条带点样效果；d 加标辣椒粉提取物和四组分苏丹红(5.0 μg/mL)。展开条件(正己烷/丙酮/冰乙酸=65∶35∶1)。

针对高油脂含量的辣椒油样品，图3显示了混合标准溶液、辣椒油样品提取液分别处于点状点样模式和条带点样模式下的TLC分离效果。试验表明4种标准化合物可以与油脂中大部分的杂质色素分开，在该板中加入的4种苏丹红染料标准物质也位于同一Rf区，清晰地观察到4种苏丹红染料的靶区，但其宽度有所增加，宽度扩展到约5～7mm左右。与低油脂含量加标样品相比，这一结果可能是由于在高浓度的油脂干扰下待测组分在层析条带分离效能受到影响，显示出油脂基质对当前层析净化条带的干扰明显，一定程度上降低了层析条带的分离属性。油脂中主要干扰物质主要有多种脂类、植物甾醇、角鲨烯等[18]。本实验中油脂主要的干扰基质已与4种苏丹红组分完全分离，而这些物质被认为是对质谱分析产生明显的基质干扰。由图3可知到位于下部的油区，目标化合物位移至上部，但目标区的宽度明显大于辣椒粉提取物的宽度。

注：A：辣椒油油脂样品点状点样2平行和标准2点样平行，10 ug/mL，B：辣椒油油脂样品条带的上样。

2.4 净化效果的比较

固相萃取是一种有效可靠的样品净化手段，商业化的固相萃取柱结合有关自动装置可以获得较为满意的重现性和高通量。对本研究选择的污染物苏丹红而言，尽管苏丹红染料的净化用固相萃取盒种类繁多，但通常选择正相SPE是因为苏丹红Ⅰ和苏丹红Ⅱ在中性极性官能化聚合物[1,19]上保留较好，GB/T19681—2005使用中性氧化铝柱可以对辣椒粉油等样品实现净化[1]。然而，在实际样品检测中，中性氧化铝柱表现并不令人满意，特别针对高油脂含量样本，其洗脱流出物仍然有较多的基质干扰物质，其中大部分为脂类化合物。为了进行考查本研究净化策略的效果，故采用苏丹红专用净化小柱作为比对，对辣椒粉和辣椒油样品分别进行SPE与薄层层析净化。比较苏丹红专用柱和当前纸基薄层净化溶液，萃取物的目视净化效果表明，两种净化方法在均可以获得澄清透明的净化溶液，对两种净化方式而言，大部分的肉眼可见杂质已被净化洗脱完全，见图4。然而，还有一些基质干扰化合物不是直接可见的，因此有必要进一步通过仪器的信号噪音比等指标考查评估净化效率。

注：a 辣椒粉提取液；b 辣椒粉提取液的SPE净化效果；c 辣椒粉提取液的TLC净化效果；d 辣椒油正己烷稀释液；e 辣椒油的SPE净化效果；f 辣椒油的dTLC净化效果。

图5 液相色谱-串联质谱测定4种苏丹红的总离子流图

根据1.5中的条件建立了4种苏丹红的液质联用快速分析方法，从图5可以看到4种苏丹红染料峰形良好，满足检测要求。为了进一步考察SPE和TLC方法的净化效果，对经过上述前处理方法的辣椒油样品进行了LC-MS/MS分析，以基质效应(Martrix effect，ME)对净化效果进行验证。基质效应是由基质中干扰物与分析物的色谱共流出所导致的质谱信号干扰现象，其计算公式为ME=(基质空白溶液加标信号强度/空白溶剂加标信号强度)×100%。从表2可知，TLC方法能够显著降低4种苏丹红的基质效应，4种苏丹红基质效应范围为67.6%～91.2%，而SPE方法仍然具有较强的基质抑制作用，如苏丹红Ⅱ达到了32.6%，显著降低了方法的灵敏度。

表2 不同净化方式的对苏丹红基质效应的影响

表3显示了2种方法在处理时间、溶剂消耗方面的差异性，可以看出与常规固相萃取方法相比，当前开发的柔性纸基净化条带方法具有明显优势。

表3 不同净化方式的时间与溶剂消耗对比

2.5 最低定量限、线性范围与回收率分析表现

根据仪器分析工作曲线斜率并结合实际表现，在TLC净化方法下，辣椒油中苏丹红Ⅰ～Ⅲ的定量限均为1.0μg/kg，苏丹红Ⅳ的定量限为2.0μg/kg，线性范围在0.002～0.5mg/kg。对当前净化策略下3种加标浓度(2、10、200μg/kg)的加标样品进行了回收试验。证明当前分析方法可以满足国标方法的要求[20]。如图6所示，加标回收率(外标法)在63%～85%，说明当前分析方法能够满足分析要求。其中苏丹红Ⅲ和苏丹红Ⅳ回收率较低，可能与TLC条带上吸附性较强有关，在今后实验中我们可以继续改进洗脱液配比，从而进一步提升苏丹红Ⅲ和苏丹红Ⅳ的回收水平。

图1 四种苏丹红染料在两种加标水平上回收率表现(n=5)

3 讨论与结论

有研究人员发现，测定油脂样本如辣椒油样品时，无论使用欧盟03/99文件对苏丹红的检验方法以及《食品中苏丹红染料的检测方法-高效液相色谱法》(GB/T19681—2005)，对色谱柱的柱效影响很大。原因是植物油脂类黏度大，易于成膜，只要极少量的油脂通过色谱柱，易被柱子的微孔聚硅烷固定相吸附，造成流动相移动受阻，导致柱压升高，对检测结果造成影响。所以，测定这些油脂样品时，样品数量不宜过多，且测试完后，需要长时间用流动相冲洗色谱柱，使其回复到正常柱压[21]。而本方法建立的净化策略可以对待测底物和油脂基质实现完全分离净化，样品中油脂清除干净，液相色谱柱柱压回复良好，表明当前方法对仪器的良好兼容性。

虽然在LC-MS或GC-MS中，应用基质匹配校准标准实际上是避免基质效应的最常用方法，但是通过改进样品制备技术以提供可靠的痕量检测结果更为有用。当前研究表明，作为一种快速的前处理替代方法，高效薄层色谱法显示出良好的潜力，被证明是一种经济、可靠和快速的方法。通过分离-裁切-洗脱目标化合物区，当前开发的柔性纸基色谱对基质的清除过程非常有效，同时也能达到高通量的清除。只需要很小的样品体积，并且每个样品仅需要大约1～5mL的溶剂消耗。此外，目前制造的TLC纸基条带是具有成本效益的，根据样品的类型的不同可以灵活的设计目标化合物的靶标区域。对于原料辣椒粉样品，由于萃取物校准非常干净，所以分析校准几乎可以用纯溶剂标准进行。因此，可以避免基体效应。对于高油脂类样品，目前的净化策略提供了更简单的制备工艺，但是这种方法还需要进一步改进。

通过与SPE比较，2种基质中4种苏丹红化合物的平均回收率在63%～85%之间，相对标准偏差小于10%，证实了有效的净化。目前的一次性纸基薄层条带有效地降低了基质效应，这项技术仍在发展中，目前制造的纸基板还需要进一步改进。但是，在痕量分析的其他领域，如多环芳烃或真菌毒素方面，它具有很大的改进和扩展潜力。所开发的带有不同改性固定相修饰的一次性纸基条带不仅可用于液相色谱，而且拓展应用于气相色谱-质谱等仪器分析平台，对于一些高复杂基质样品如水产品或环境样品将是下一个挑战。