龙胜基， 吴 义， 张 楠， 李伟航， 胡承兴

(1.贵州省黔西南州环境保护监测站，贵州 兴义 562400； 2.贵州省黔西南州环境工程评估中心，贵州 兴义 562400； 3.天津海化环境工程有限公司，天津 300000)

噻霉酮是一种新型、高效、低毒且广谱型的杀菌剂[1]。在国内，噻霉酮产品主要用于防治烟草野火病、黄瓜霜霉病等；欧美等发达国家主要用于工业杀菌、防腐及防霉等[2-4]。目前，有关噻霉酮残留分析检测和消解动态的研究以及与噻霉酮结构类似化合物的分析方法文献报道较少。于福利等[5]报道了噻霉酮在黄瓜和土壤中的残留分析方法。张雯[6]采用高效液相色谱法测定噻霉酮含量。郑静等[7]运用紫外分光光度法测定杀菌剂1,2-苯并异噻唑啉-3-酮(BIT) 的含量。 赵明仁等[8]建立了非水滴定法测定苯并异噻唑啉酮的含量。杨荣静等[9]建立液相色谱-串联质谱(LC-MS) 法快速测定玩具中与噻霉酮结构类似化合物异噻唑啉酮类防腐剂(2-甲基4-异噻唑啉-3-酮、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和1,2-苯并异噻唑啉-3-酮)。龙家寰等[10]建立气相色谱-质谱联用快速检测杨梅中噻嗪酮残留量的方法。段婷婷等[11]建立黄瓜、番茄和土壤中噻唑磷的残留量检测方法。此外，与其结构类似的农药品种如克百威和多菌灵等的分析主要采用色谱-质谱联用等[12-17]。噻霉酮在烟草上施用的安全性、消解趋势及残留水平等方面的研究未见报道。鉴于此，分别在湖南和贵州采用田间试验研究噻霉酮在烟草中的消解动态，探索其消解半衰期，以期为噻霉酮在烟草上的推广使用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 烟草采自湖南长沙湖南农业大学农业环境保护研究基地和贵州惠水摆金镇烟区，烟草品种分别为K326和叶子烟。

1.1.2 仪器Waters ACQUITY UPLC超高效液相色谱系统，美国Waters公司；ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50 mm，1.7 μm)色谱柱，美国Waters公司；BUCHI R-210型旋转蒸发仪，瑞士BUCHI公司；QL-901型涡旋混合器，江苏海门市麒麟医用仪器厂；DC-12型氮吹仪，上海安谱科学仪器有限公司；ALC-210.4型电子天平，德国Sartorius公司；HY-4型调速多用震荡器，上海浦东物理光学仪器厂。

1.1.3 试剂99.8%噻霉酮标准品，Dr. Ehrenstorfer Gmbh公司；3%噻霉酮水分散粒剂，陕西西大华特科技实业有限公司研发生产；Celite545硅镁吸附剂，国药集团化学试剂有限公司；C18，天津博纳艾杰尔科技有限公司；乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈、氯化钠、无水硫酸镁及无水硫酸钠，均为分析纯。无水硫酸镁和无水硫酸钠用前640℃烘烤4 h，于干燥器中保存备用。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线绘制用电子天平称取0.01 g(精确至0.000 1 g)噻霉酮标准品置于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至50 mL，配制成浓度为200 μg/mL的标准样品母液。将噻霉酮标准样品母液用甲醇稀释配制成浓度分别为0.1 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、4.0 μg/mL、8.0 μg/mL及10.0 μg/mL的标准溶液。

1.2.2 材料预处理

1) 消解动态。在烟草旺长期后施药1次，施药剂量为60 g a.i/hm2，3次重复，每个小区30 m2，处理间设保护带，另设空白对照区，注意保证烟叶均匀着药。分别在施药后2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、21 d、28 d、42 d和60 d时在各小区随机采样。每小区每次采集生长正常、无病害的烟草鲜叶80～100片左右，去除叶面附着的杂物后，切成1 cm2左右的碎叶，充分混合均匀，用四分法缩分，取150 g样品各2份分别装入样品容器中，包扎妥当、贴好标签，置于-20℃冰柜中保存备用。

2) 最终残留。田间试验施药剂量设40 g a.i/hm2和60 g a.i/hm2，以空白作对照，于收获期分别施药3次和4次，每次施药间隔期为7 d，每组设3个重复小区，共6个小区，每个小区面积30 m2。于施药后7 d、14 d及21 d分别在小区内随机采集烟草样品。每小区每次采集生长正常、无病害的烟草鲜叶180～240片左右，按不同处理分别编竿、挂签和烘烤。将烤后的成品烟叶磨碎，充分混匀并用四分法缩分，取150 g样品各2份分别装入容器中，包扎妥当、贴好标签，置于-20℃冰柜中保存备用。

3) 添加标准样品回收试验。预备试验发现，鲜烟叶基质添加浓度低于0.09 mg/kg时未检出噻霉酮，烟粉基质添加浓度低于0.4 mg/kg时未检出噻霉酮，因此，添加回收试验鲜烟叶基质选取添加回收浓度分别为0.1 mg/kg、0.4 mg/kg和1.0 mg/kg，烟粉基质选取添加回收浓度分别为0.5 mg/kg、2.0 mg/kg和5.0 mg/kg。根据检测结果计算鲜烟叶和烟粉基质中添加回收率、相对标准偏差范围。同一浓度的回收试验3次重复，平行试验结果偏差与添加浓度相关，添加浓度愈低，容许偏差越大。因此，平均添加回收率要求为70%～110%。

1.2.3 农药残留检测

1) 鲜烟叶。称取10 g烟叶样品置于150 mL锥形瓶中，然后加入80 mL乙酸乙酯，振荡提取1 h后取出。在铺有Celite545的砂芯漏斗中抽滤，再用20 mL乙酸乙酯洗涤容器与残渣后，合并滤液。滤液过无水硫酸钠干燥后转移至150 mL梨形瓶中，40℃旋蒸浓缩并用氮气吹干。向梨形瓶中加入0.05 g C18和0.1 g无水MgSO4，用1 mL甲醇定容，涡旋1 min，经0.22 μm滤膜过滤后待测。

2) 烟粉。称取2 g烟粉样品置于100 mL锥形瓶中，加入80 mL乙腈与水的混合溶液(V∶V为7∶3) 作为提取剂，超声20 min。在铺有Celite545的砂芯漏斗中抽滤，再用20 mL上述混合溶液洗涤容器与残渣，合并滤液。将滤液转移至150 mL梨形瓶中，45℃旋蒸浓缩。将上述除去乙腈后的水相转移至250 mL分液漏斗中，加入20 mL饱和氯化钠水溶液，用50 mL、40 mL及30 mL二氯甲烷分3次萃取，每次5 min，收集下层有机相；有机相过装有无水硫酸钠和脱脂棉的三角漏斗，将合并后的有机相在40℃旋蒸浓缩至近干，然后用氮气吹干。用甲醇定容至1 mL后用0.22 μm膜过滤，待测。

1.2.4 色谱条件检测仪器：超高效液相色谱仪；检测器：PDA检测器；色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50 mm，1.7 μm)；检测波长：320 nm；进样量：1.0 μL；流速：3 mL/min；柱温：40℃；流动相：甲醇∶水(10∶90，V∶V)。

1.3 数据统计与分析

采用外标法定量，噻霉酮的定量公式：

式中，CB为样品中噻霉酮的含量(mg/kg)，WB为进样样品中噻霉酮的检出量(μg)，VB为定容体积(mL)，AB为进样体积(μL)，MB为样品的质量(kg)。

消解动态方程计算公式：

C=C0e-kt

式中，C为农药在t时刻的残留量(mg/kg)，C0为农药的初始浓度(mg/kg)，k为降解速率常数，t为降解时间(d)。

由上面公式求出农药的消解半衰期T1/2，即T1/2=ln2/k。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线

由图1看出，波长320 nm条件下噻霉酮标准溶液的含量与吸光度呈线性关系，其峰面积相对标准偏差为0.20%～2.56%，线性方程为y=5 581.1x+57.50(R=0.999 8)，表明，线性关系良好。

图1噻霉酮的标准曲线

2.2 方法的灵敏度、精密度和准确度

由表1可知，鲜烟叶添加水平为0.1～1.0 mg/kg时，平均回收率分别为73.34%～86.06%，相对标准偏差为5.12%～7.28%；烟粉的添加水平为0.5～5.0 mg/kg时，平均回收率为77.41%～84.90%，相对标准偏差为4.76%～5.64%。表明，鲜烟叶和烟粉中噻霉酮的最低检测浓度分别为0.1 mg/kg和0.5 mg/kg。说明，该方法的准确度和精密度均达中华人民共和国农业行业标准NY/T 788—2004[18]，符合农药残留检测要求。

表1贵州和湖南烟区鲜烟叶及烟粉中噻霉酮的添加回收率

Table 1 Adding recovery rate of benziothiazolinone in fresh tobacco leaves and tobacco powder in Guizhou and Hunan tobacco areas %

处理/(mg/kg)Treatment添加回收率 12345平均RSD鲜烟叶0.190.6383.0384.2790.9682.4086.065.120.466.7475.5381.0871.3272.0473.347.281.079.5978.9771.2580.4474.0776.865.20烟粉 0.588.1789.8399.0486.1777.8884.905.642.082.3372.4679.2575.9377.0977.414.765.083.8675.7380.8085.9287.3682.745.59

2.3 噻霉酮在烟草中消解动态

由表2和图2看出，施药后随时间延长，贵州和湖南烟草中噻霉酮的残留量均呈下降趋势。施药当天的检出量分别为0.512 8 mg/kg和0.432 9 mg/kg；施药7 d后，噻霉酮在贵州和湖南烟草样品中的残留量均低于最低检测浓度(0.1 mg/kg)，降解率分别>80%及>76%，且其半衰期(T1/2)分别为2.8 d和3.1 d，动力学方程分别为C贵州=0.470 3 e-0.248 8 t(R=-0.976 9)及C湖南=0.412 8 e-0.224 4 t(R=-0.960 3)。说明，噻霉酮在烟草中的消解动态符合一级动力学方程，消解速率较快。

表2贵州和湖南烟区烟草中噻霉酮的消解动态

Table 2 Digestion dynamics of benziothiazolinone in tobacco from Guizhou and Hunan tobacco areas

采样时间(d)Sampling time湖南省长沙市Changsha City of Hunan Province残留量/(mg/kg)降解率/%贵州省惠水县Huishui County of Guizhou Province残留量/(mg/kg)降解率/%00.432 9-0.512 8-10.332 723.170.407 620.5120.323 625.26--30.157 363.670.176 365.6150.118 872.560.116 577.297<0.100 0>76.90<0.100 0>80.5010<0.100 0>76.90<0.100 0>80.5014<0.100 0>76.90<0.100 0>80.5021<0.100 0>76.90<0.100 0>80.5028<0.100 0>76.90<0.100 0>80.5042<0.100 0>76.90<0.100 0>80.5060<0.100 0>76.90`<0.100 0>80.50

注：—表示无数据。

Note:— means no data.

2.4 噻霉酮在烟草中最终残留

从图3可见，噻霉酮标样色谱峰形较好，在试验设定检测色谱条件下保留时间为6.2 min左右。经检测发现，在该检测色谱条件下贵州和湖南烟草和烟粉样品中噻霉酮未出峰，即峰面积视为0，浓度为0。表明，烟草和烟粉样品中噻霉酮的最终残留量为未检出(<最低检测浓度0.1 mg/kg)。从图4和图5可见，根据上述样品前处理方法及色谱条件，噻霉酮与样品基质峰能够很好分离，杂质峰对噻霉酮检测的干扰较小。

图2贵州和湖南烟区烟草样品中噻霉酮的消解曲线

Fig.2 Digestion curve of benziothiazolinone in tobacco samples from Guizhou and Hunan tobacco areas

Fig.3 Chromatography of benziothiazolinone standard sample

注：a，鲜烟叶空白样品；b，鲜烟叶样品加标回收；c，鲜烟叶样品。

Note：a, fresh tobacco leaf blank control; b, fresh tobacco leaf adding recovery; c, fresh tobacco leaf sample.

图4鲜烟叶样品中噻霉酮的残留量色谱

Fig.4 Residue chromatogram of benziothiazolinone in fresh tobacco samples

注：a，烟粉空白样品；b，烟粉样品加标回收;C,烟粉样品。

Note: a, tobacco powder blank control; b, tobacco powder adding recovery；C,tobacco powder smple.

图5烟粉样品中噻霉酮的残留量色谱

Fig.5 Residue chromatogram of benziothiazolinone in tobacco powder samples

3 结论与讨论

研究结果表明，贵州和湖南烟区烟草中噻霉酮的消解半衰期为2.8～3.1 d。施药7 d后，噻霉酮残留量均低于最低检测浓度 (0.1 mg/kg)，消解速率较快。3%噻霉酮水分散粒剂施药量为40～60 g a.i/hm2，每次施药间隔期为7 d，烟草样品在距末次施药7 d、14 d及21 d时噻霉酮的残留量均低于0.5 mg/kg，表明3%噻霉酮水分散粒剂在推荐剂量下使用安全。建议：3%噻霉酮水分散粒剂在烟草野火病发病前或发病初期或烟草旺长期使用，最高使用剂量为60 g a.i/hm2，每季最多使用3次。