张吉松, 张 卓, 张德咏, 张战泓, 刘 勇, 史晓斌,*, 张友军

(1. 湖南农业大学植物保护学院, 长沙 410125; 2. 中国农业科学院蔬菜花卉研究所, 北京 100081; 3. 湖南省农业科学院植物保护研究所, 长沙 410125; 4. 湖南省农业科学院蔬菜研究所, 长沙 410125)

烟粉虱Bemisiatabaci隶属于半翅目(Hemiptera)粉虱科(Aleyrodidae)，现在普遍认为烟粉虱是一个至少由36种形态上无法区分但遗传结构差异显著的隐存种组成的隐存种复合群(cryptic species complex)(刘银泉和刘树生, 2012; 刘健全, 2016; 刘树生, 2016; 徐伟和车静, 2019)。目前主要利用线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ(mitochondrial cytchrome oxidase Ⅰ, mtCOⅠ)基因酶切法来区分。中国境内危害最严重的两种烟粉虱隐存种分别是：起源于中东和小亚细亚地区的Middle East-Asia Minor 1烟粉虱，简称MEAM1，也称B型烟粉虱；起源于地中海地区的Mediterranean烟粉虱，简称MED，也称Q型烟粉虱(Chuetal., 2010; Huetal., 2011)。MED目前已经是国内田间优势种群，但还存在MEAM1和MED混合发生的情况(Zhengetal., 2021)。烟粉虱传播多种植物病毒病，影响植物生长、造成植物减产是烟粉虱严重危害世界农业安全的方式之一。烟粉虱可以传播200余种植物病毒，主要包括番茄褪绿病毒(tomato chlorosis virus, ToCV)等(Jones, 2003; 卫静等, 2015)。

ToCV隶属于长线形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒属Crinivirus。ToCV主要通过媒介昆虫烟粉虱以半持久非循环方式传播(Polstonetal., 2014; Orfanidouetal., 2016)。ToCV的流行与烟粉虱的发生密切相关(Shietal., 2018)。 该病毒的寄主主要有茄科(Solanaceae)和夹竹桃科(Apocynaceae)等7个科的植物(Wintermantel and Wisler, 2006; 周涛等, 2014)。ToCV的不同传毒介体其传毒能力有差异，尤其是在烟粉虱中，与烟粉虱的种类、数量和取食时间密切相关，例如ToCV在MEAM1中保留时间为2 d，但是在MED中保留时间达到6 d(Wintermantel and Wisler, 2006)；番茄上ToCV感病株率随着带毒MED烟粉虱数量与取食时间的增加而明显升高等(代惠洁等, 2016; Orfanidouetal., 2016)。

辣椒Capsicumannuum是中国的重要蔬菜和调味品，据不完全统计，目前全国辣椒播种面积130万hm2，产量2 700万t，年产值达270亿元(徐小万等, 2008)。烟粉虱及其传播的ToCV病毒病是为害辣椒的重要因素，严重影响辣椒的产量和品质。关于烟粉虱-ToCV-辣椒三者之间的互作关系还尚未探究过，尤其是烟粉虱在辣椒上的获毒和传毒特性，以及烟粉虱对健康和带毒辣椒的取食偏好，明确这些问题将帮助我们采取有效措施对辣椒病毒病进行防控。

本研究通过利用室内饲养的烟粉虱MEAM1和MED成虫及ToCV cDNA侵染性克隆，对MEAM1和MED在辣椒上获取和传播ToCV能力进行比较研究，同时比较它们对健康和携带ToCV辣椒的取食偏好。分析不同烟粉虱隐种在辣椒上传播ToCV的差异，解析昆虫-病毒-植物之间复杂的互作关系，用于指导田间及辣椒种植区防治烟粉虱和ToCV病毒病。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫和植物

1.1.1烟粉虱：由中国农业科学院蔬菜花卉研究所馈赠。烟粉虱MEAM1和MED都饲喂在番茄植株上，并在温室中隔离饲养，温度条件：平均温度25±2℃，相对湿度70%±5%，光周期14L∶10D。在实验之前，将烟粉虱MEAM1和MED分别转移至健康的辣椒苗上分开饲养，并且每隔2个月通过提取烟粉虱的DNA，使用mtCOⅠ酶切鉴定方法(Khasdanetal., 2005; Chuetal., 2010)进行种群鉴定，饲养6代后的成虫用于本实验。

1.1.2辣椒：由湖南省农业科学院蔬菜所提供，品种为自交系6421，并在温室内种植，温室条件：平均温度26±2℃，相对湿度70%±5%，光周期14L∶10D。期间没有使用任何农药以及接触昆虫。

1.2 辣椒感染ToCV

ToCV侵染性克隆由中国农业大学植物保护学院周涛老师课题组构建与馈赠。由于ToCV侵染性克隆接种辣椒的成功率较低，因此首先用ToCV侵染性克隆接种黄瓜，确认黄瓜带毒之后，用健康烟粉虱取食已感染ToCV的黄瓜植株48 h，用吸虫器吸取50头获毒后的烟粉虱放入微虫笼中并将其夹在健康辣椒植株(4-5叶期)的底部叶片进行传毒，4 d后移去烟粉虱并摘掉该叶片。25 d后检测传毒是否成功，确认感染ToCV的辣椒植株可用于后续试验。

1.3 烟粉虱获取ToCV能力测定

取刚羽化的健康烟粉虱MEAM1和MED成虫，分别放在不同的干净养虫笼中，用微虫笼分别将其夹在感染ToCV的辣椒植株上，每个处理用20棵辣椒植株，每棵辣椒植株放5个微虫笼，每个微虫笼内放40头烟粉虱成虫。设置6个接虫时间(接虫后6, 12, 24, 48, 72和96 h)，在每个时间点分别从接有烟粉虱MEAM1和MED成虫的辣椒植株中随机选取3棵，每棵取虫各20头，存放于-80℃冰箱。最后提取烟粉虱成虫RNA，用荧光定量PCR法分别测定不同时间内烟粉虱MEAM1和MED成虫体内ToCV表达量，与未在感染ToCV的辣椒植株上取食的烟粉虱体内ToCV表达量对比，测定烟粉虱的获毒量。ToCV的qPCR扩增引物设计根据其外壳蛋白(coat protein, CP)序列设计(Shietal., 2018): ToCV-2F: 5′-ATGGAGAACAGCCGTTGG-3′; ToCV-2R: 5′-TTAGCAACCAGTTATCGATGC-3′; WF-F: 5′-CTTGGTAACTCTTCTGTAGATGTGTGTT-3′; WF-R: 5′-CCTTCCCGCAGAAGAAATTTTGTTC-3′；烟粉虱内参基因Actin和EF-1α引物参考Shi等(2018)设计: Actin-F: 5′-CGCTGCCTCCACCTCATT-3′; Actin-F: 5′-ACCGCAAGATTCCATACCC-3′; EF-1αF: 5′-TAG CCTTGTGCCAATTTCCG-3′; EF-1αR: 5′-CCTTCAG CATTACCGTCC-3′。根据购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司(Vazyme)的AceQ®qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒的操作说明书，反应体系: 2×AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10 L, 正反向引物各0.4 μL, cDNA 1 L, ddH2O 8.2 μL。反应程序: 95℃ 1 min; 95℃ 10 s, 60 ℃ 30 s, 40次循环。利用qTOWER3G qPCR仪(Analytik Jena公司)进行检测。反应结束后采集目的基因和内参基因的Ct值，采用2-ΔΔCt法(Livak and Schmittgen, 2001)分析基因的相对表达量。每个处理重复3次。

1.4 烟粉虱传播ToCV能力测定

选取携带ToCV的烟粉虱MEAM1和MED成虫1, 10和30头3组，按1.2节获毒48 h后将其分别转移到3片叶片的健康小辣椒苗上。接毒48 h后，将烟粉虱吸走，并分别将通过烟粉虱MEAM1和MED成虫接毒后的植物放入不同的干净养虫笼中进行培养，1, 10和30头的处理组在接毒后30 d时检测其是否带毒，30头的处理组分别在接毒后30, 40, 50和60 d 时取对应的辣椒叶片，提取叶片RNA，用荧光定量PCR法比较叶片带毒量与未接触获毒48 h后的烟粉虱的叶片进行对比，比较烟粉虱MEAM1和MED成虫在辣椒上的传毒量的差异，方法同1.3节。烟粉虱内参基因Actin和UBI引物参照Shi等(2018)设计: Actin-F: 5′-GGAAAAGCTT GCCTATGTGG-3′; Actin-R: 5′-CCTGCAGCTTCCAT ACCAAT-3′; UBI-F: 5′-TCGTAAGGAGTGCCCTAAT GCTGA-3′; UBI-R: 5′-CAATCGCCTCCAGCCTTGTT GTAA-3′。每个处理重复3次。

1.5 烟粉虱对辣椒植株的取食选择性测定

分别取1株感染ToCV和1株健康辣椒放入干净的养虫笼中(两株辣椒生长情况相同)，二者间隔20 cm。每个养虫笼为1个重复，共设6个重复。早上6:00-7:00时，用吸虫器吸取饲养在健康辣椒上取食的健康烟粉虱MEAM1和MED成虫各约100头，分别将其转移至干净的1.5 mL离心管中，并将离心管放于2棵植物下端的中心处，打开离心管的盖子，让烟粉虱自行爬出离心管进行取食选择。在烟粉虱做完选择后调查每株辣椒上烟粉虱的数量，每个处理重复3次。

1.6 数据分析

采用SPSS2.0(SPSS Inc., Chicago, IL, 美国)对数据进行分析，用重复测量方差分析(repeated measures ANOVA)用于分别比较烟粉虱MEAM1和MED成虫在获毒、传毒方面的差异；比较烟粉虱对辣椒取食选择性的数据采用Generalized Linear Model方差分析，并用Duncan氏多重比较进行差异显著性分析，显著水平设为P<0.05；作图采用GraphPad Prism 7。

2 结果

2.1 烟粉虱获取ToCV能力

通过在感染ToCV辣椒植株上取食的烟粉虱体内ToCV表达量进行对比发现，在携带ToCV的辣椒植株上，随着取食时间的增加，烟粉虱MEAM1和MED成虫体内病毒的积累量均逐渐增多。同时，烟粉虱MED成虫病毒积累量的上升趋势快于烟粉虱MEAM1成虫，且烟粉虱MED成虫能从携带ToCV的辣椒植株上获得更多病毒，接虫后96 h时，烟粉虱MED成虫获毒量是烟粉虱MEAM1成虫的1.74倍，两者差异极显著(P<0.001)(图1)。

图1 烟粉虱MEAM1和MED成虫在携带ToCV的辣椒植株上的获毒量差异Fig. 1 Differences in the level of virus acquisition by Bemisiatabaci MEAM1 and MED adults on ToCV-infectedCapsicum annuum plants图中数据为平均值±标准误；柱上星号表示两组间差异显著(*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001)(重复测量方差分析)。Data in the figure are mean±SE. Asterisks above bars indicate significant difference between two groups (*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001)(repeated measures ANOVA).

2.2 烟粉虱传播ToCV能力测定

对1, 10和30头烟粉虱MEAM1和MED成虫在辣椒植株上的传毒率进行对比发现，10和30头烟粉虱成虫传毒后，烟粉虱MED成虫的传毒率显著高于烟粉虱MEAM1成虫的(P<0.05)，传毒率平均相差29%，此外，随着烟粉虱数量的增加，烟粉虱MED和MEAM1成虫在辣椒植株上的传毒率也增加(图2)。

图2 不同数量烟粉虱MEAM1和MED成虫在辣椒植株上的传毒率差异Fig. 2 Differences in the virus transmission rate by different numbers of Bemisia tabaci MEAM1 and MED adults on Capsicum annuum plants图中数据为平均值±标准误；柱上符号表示两组间差异显著性(nsP>0.05; *P<0.05)(重复测量方差分析)。图3同。Data in the figure are mean±SE. Symbols above bars indicate significance of difference between two groups (nsP>0.05; *P<0.05)(repeated measures ANOVA). The same for Fig. 3.

根据传毒率试验结果，选用30头烟粉虱成虫的传毒量进行对比发现，接毒40和50 d后，烟粉虱MED的传毒量均显著高于烟粉虱MEAM1的(P<0.05)，烟粉虱MED成虫传毒量平均是烟粉虱MEAM1成虫的10倍(图3)。

图3 烟粉虱MEAM1和MED成虫在辣椒植株上接虫后不同时间的传毒量差异Fig. 3 Differences in the level of virus transmission inCapsicum annuum plants transmitted by Bemisiatabaci MEAM1 and MED adults at different time after inoculation每植株接种30头烟粉虱成虫进行传毒量测定。On each plant 30 adults of B. tabaci were inoculated to determine the level of virus transmission.

携带ToCV的两种烟粉虱侵染的辣椒植株和叶片的症状也完全不一样，被烟粉虱MED成虫侵染的辣椒有明显的褪色变形，症状比被烟粉虱MEAM1成虫侵染的更加明显(图4和5)。

图4 被携带ToCV的烟粉虱MED(A)和MEAM1(B)成虫侵染后的辣椒植株症状Fig. 4 Symptoms of Capsicum annuum plants infected by Bemisia tabaci MED (A) and MEAM1 (B) adults carrying ToCVA: 接种带ToCV的MED成虫的辣椒植株C. annuum plants infected with MED adults carrying ToCV; B: 接种带ToCV的MEAM1成虫的辣椒植株C. annuum plants infected with MEAM1 adults carrying ToCV.

图5 烟粉虱MEAM1和MED成虫传毒后的辣椒叶片症状Fig. 5 Symptoms of Capsicum annuum leaves infected by viruliferous Bemisia tabaci MEAM1 and MED adultsA: 接种携带ToCV的MED成虫的辣椒叶片C. annuum leaf infected with MED adults carrying ToCV; B: 接种携带ToCV的MEAM1成虫的辣椒叶片C. annuum leaf infected with MEAM1 adults carrying ToCV.

2.3 烟粉虱对辣椒植株的取食选择性

可以发现，健康的烟粉虱MEAM1和MED成虫对健康和感染ToCV辣椒植株取食趋向相似，即健康的烟粉虱MEAM1和MED成虫皆倾向于取食被ToCV侵染的辣椒植株，并且烟粉虱MED成虫选择感染ToCV的辣椒植株的数量高于烟粉虱MEAM1成虫(图6)。

图6 烟粉虱MEAM1和MED成虫对辣椒植株的取食选择性Fig. 6 Feeding preference of Bemisia tabaci MEAM1 and MED adults to Capsicum annuum plantsNV: 健康辣椒植株Healthy C. annuum plants; V: 携带ToCV的辣椒植株C. annuum plants carrying ToCV. 图中数据为平均值±标准误；三星号表示两组间差异极显著(P<0.001, 重复测量方差分析)。Data in the figure are mean±SE. The triple asterisks indicate extremely significant difference between two groups (P<0.001, repeated measures ANOVA).

3 结论与讨论

ToCV首次在佛罗里达州被报道之后，在十几年时间内迅速传遍世界，2004年在我国台湾首次发现 (Tsaietal., 2004)，之后又在我国山东被报道发现，很快传播到其他地区，造成极大危害(Tzanetakisetal., 2013; Zhaoetal., 2013)。ToCV不能靠汁液摩擦传播，仅靠媒介昆虫粉虱进行传播，虽然ToCV是辣椒上的重要病害之一，然而不同烟粉虱在辣椒上传播量和传播效率仍缺乏研究，而明确这些问题能够帮助我们提前采取措施，减少ToCV在辣椒上的发生。

烟粉虱在感染ToCV辣椒植株上的获毒试验表明，烟粉虱MEAM1和MED成虫在带毒的辣椒植株上0-96 h获毒量逐渐积累，烟粉虱MED成虫的获毒能力总体比烟粉虱MEAM1成虫强(图1)，该结果与在研究携带ToCV番茄上烟粉虱MEAM1和MED成虫获取ToCV差异结果(Shietal., 2018)相似。不同的是，在相同时间内，烟粉虱在辣椒上的获毒量低于烟粉虱在番茄上的获毒量，可能是由于感染ToCV后，番茄比辣椒更适合烟粉虱。此外，不同试验环境和不同的操作也可能会造成差异。

烟粉虱在辣椒植株上的ToCV传毒试验表明，烟粉虱MED成虫传毒能力高于烟粉虱MEAM1成虫(图2)，该结果与研究携带ToCV的烟粉虱MEAM1和MED成虫在番茄上传毒能力的试验结果(Shietal., 2018)相似。本研究还发现，随着烟粉虱数量的增加，烟粉虱MED的传毒量高于MEAM1，并造成了辣椒植株上更为显著的褪绿症状(图4和5)。烟粉虱传播番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)的结果表明烟粉虱MED成虫的获毒和传毒能力都强于烟粉虱MEAM1成虫(Panetal., 2013; Ningetal., 2015)，证明烟粉虱MED成虫在不同寄主上传播病毒的能力均高于烟粉虱MEAM1成虫。不仅烟粉虱MED成虫相较于烟粉虱MEAM1在一些杂草和农作物上有更强的生物学优势(Muiz and Nombela, 2001)，而且对化学杀虫剂产生了极高的抗性(Horowitzetal., 2005)。烟粉虱MED作为目前我国主要的田间种群，且其传播ToCV的能力很强，因此导致了目前我国ToCV发生严重(胡荣等, 2020)。本实验创新性地研究了被携带ToCV的烟粉虱成虫侵染后的辣椒发病症状的差异，发现被携带ToCV的烟粉虱MED成虫侵染的辣椒植株症状更加严重，这是之前关于烟粉虱MEAM1和MED成虫在作物上传毒所没有注意到的差异。这能在一定程度上为ToCV在田间辣椒上的早期防控提供了参考。

健康烟粉虱MEAM1和MED成虫均趋向于取食感染ToCV的辣椒植株，且烟粉虱MED成虫更偏向于选择带毒辣椒植株(图6)，说明健康的烟粉虱可能被携带ToCV的辣椒植株所吸引，当烟粉虱通过取食获得ToCV之后，能够更好地传播ToCV。在对烟粉虱传播的其他双生病毒的试验中，研究结果也与此相似(纠敏等, 2006)。推测可能ToCV侵染改变了辣椒的挥发物进而吸引了烟粉虱进行取食，这还需要进一步的试验验证。另一方面，有研究指出辣椒对烟粉虱具有较强的抗异种作用，辣椒不是烟粉虱的最适寄主，相较之下，烟粉虱更愿意选择其他更适宜生活的寄主。并且发现烟粉虱MED比烟粉虱MEAM1对辣椒的耐受性更强(Iidaetal., 2009; Tsueda and Tsuchida, 2011; Jiaoetal., 2014)。本研究所得烟粉虱MED比烟粉虱MEAM1在辣椒植株上获取和传播ToCV能力更强，更能接受辣椒寄主的结果与此结论达成了一致。

辣椒与番茄同为在经济作物中主要的两大茄科植物，之前的研究多以番茄为主，本实验系统研究了烟粉虱在辣椒植株上获毒和传毒的特点，及不同烟粉虱传毒后，感染ToCV的辣椒植株的不同发病症状。ToCV由烟粉虱以半持久方式传播，而TYLCV由烟粉虱以持久方式传播，研究发现烟粉虱传播不同病毒的特性存在相似性，间接证明了烟粉虱MED较强的传毒能力。同时有文献报道，被ToCV与TYLCV复合侵染的烟粉虱成虫对ToCV的获毒和传毒能力显著增强(廖锦钰等, 2021)，说明了烟粉虱在田间传播ToCV和TYLCV是存在相互促进作用的，但具体机制还有待于进一步研究。这些都说明了在我国蔬菜病毒病的发生与烟粉虱MED有着密切的联系。本研究还发现，随着烟粉虱数量的增加，烟粉虱的传毒能力也显著增强(图2)，因此，应在早期预防烟粉虱的发生，从而降低ToCV的传播。