何 珊，马淑一，付玉华，于敬达，高 芳，蔡 琳

(1.内蒙古科技大学包头医学院医学技术学院，内蒙古 包头 014040；2.内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院检验科)

ZBED6是在研究瘦肉型猪的影响因素时发现的一个转录因子，在哺乳动物中有高度的保守性[1]。ZBED6结合在胰岛素样生长因子2(IGF2)的3号内含子区，可抑制IGF2的表达量[1]。但是关于ZBED6的研究很少，而关于其与人类疾病相关的研究更是少之又少，只在胰岛细胞和人结直肠癌细胞系中做过相关研究。发现ZBED6介导的对IGF2的调控可能与胰岛β细胞有关，因为发现在自发糖尿病小鼠中异常的IGF2产物会引起后续β细胞量的异常[2]。而且，人胰岛素基因成簇排列在IGF2附近，说明除了IGF2外，胰岛素或许也受到ZBED6依赖性方式的调控[3]。本实验采用单核苷酸多态性(SNP)的关联研究，初步探讨ZBED6基因1043A/G多态性与2型糖尿病发病的相关性。

1 资料和方法

1.1研究样本 2型糖尿病患者83例，均来自包头地区，彼此间无亲缘关系。其中男37例，女46例，年龄28-88岁。同等数量的健康对照来自同时期社区体检人群，均无2型糖尿病，且性别、年龄与患病组相匹配。

1.2聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测 (1) 提取基因组DNA：EDTA抗凝管采集研究对象静脉血，使用天根基因组DNA提取试剂盒提取外周血基因组DNA。(3)引物设计、合成：通过NCBI查找ZBED6基因序列，并使用Primer5软件设计引物，交由生物公司合成。引物序列F:TCAAGAGCTGTGTGTAATATATGTA，R: CTAACATAGGTTCATCTGAATCAGA。扩增基因序列长280 bp。(3)PCR扩增：反应体系：模板3 μl，上下游引物各1 μl，2×Taq PCR Master Mix 13 μl,去离子水7 μl。反应参数：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，33个循环，72 ℃ 5 min；(4)基因分型和测序：对PCR产物进行酶切反应，反应体系10 μl，包括PCR产物4 μl，内切酶NlaⅢ 0.2 μl，10×限制性内切酶Buffer 1 μl。37 ℃反应15 min后，电泳，分析基因型(GG型：280 bp，AA型：205和75 bp，AG型：205,280,75 bp)，随机选取患者及正常对照PCR产物各5份，送北京六合华大基因科技有限公司测序，验证酶切结果。

2 结果

2.1ZBED6基因1043A/G位点基因分型 经酶切反应确定ZBED6基因1043A/G位点只存在1种基因型AA，2型糖尿病患者与正常对照无差异，见图1。

2.2ZBED6基因1043A/G位点测序结果 PCR产物测序结果显示：ZBED6基因1043A/G位点只有1种基因型AA，与酶切结果一致，2型糖尿病患者与正常对照无差异，见图2。

图1 ZBED6基因1043A/G位点基因分型电泳图

图2 ZBED6基因1043A/G位点PCR产物测序结果

3 讨论

2型糖尿病是一种常见的内分泌代谢性疾病，其发病特点主要表现为胰岛素抵抗和/或胰岛β细胞功能受损。目前研究显示ZBED6基因的表达对胰岛β细胞的发育与功能有重要的调节和控制作用。有人证实ZBED6在胰岛素分泌细胞、小鼠胰岛及人的β细胞中均有表达。且转录因子ZBED6影响胰岛β细胞的基因表达、增殖和细胞死亡[4]， 因而可能与各型糖尿病的发病机理有关。2型糖尿病病因复杂，通常认为其发病与遗传及环境这两大因素有着密切的联系。有报道显示CAPN-10基因的单核苷酸多态性与2型糖尿病呈显著相关,尤其CAPN-10的SNP43与2型糖尿病呈显著相关[5]。有学者对中国人群进行了一项大规模的研究，该研究验证了从韩国人、新加坡华人和欧洲美国人等3个GWAS中筛选出2100个SNP，研究后发现rs1359790，rs10906115和rs1436955与2型糖尿病相关[6]。另外，也有人发现在胰岛β细胞出现的HDAC基因变异可能在糖尿病的发生中有作用[7]。目前，研究发现牛ZBED6基因存在3个对牛体重等性状有显著影响的SNP[8]，其中1043A/G位点与人最具同源性。但尚无关于人ZBED6基因1043A/G位点多态性与2型糖尿病发病关系的研究，故本课题选取了1043A/G位点，探讨其多态性以及与2型糖尿病关系。结果显示人ZBED6基因1043A/G位点无突变，均为AA型。表明2型糖尿病发病风险与1043A/G位点是否突变无相关性。虽然ZBED6基因在哺乳动物中具有高度保守性[1]，但与牛不同，在人群中此位点不存在多态性，亦或可能因标本数量不足而出现误差。在后续研究中可选择NCBI中已有的人ZBED6基因SNP位点进行分析，进一步探寻ZBED6基因多态性与2型糖尿病发病关系。以确证2型糖尿病发病是否与该基因某位点多态性相关。