李亦明， 钟碧玲， 曾伍姣， 权莉， 龙中华， 王贵明

广东省第二人民医院病理科(广东广州 510317)

胃癌是世界上分布最广泛的第四大肿瘤，也是目前世界范围内癌症相关死亡的第二大常见原因，特别是进展期胃癌的生存率较低，因为在大多数情况下，胃癌患者诊断多已处于晚期，诊断时多为进展期或合并有淋巴结转移，因此患者预后往往较差[1-2]。手术仍然是该病在手术阶段唯一比较有效的治疗方法[3]，而晚期胃癌的化疗对改善患者预后发挥重要作用。免疫应答在胃癌中的作用目前仍未明确，但最近的研究表明化疗可能引发免疫反应，这可能有助于治疗。以前的研究[4]表明，肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes,TILs)在恶性肿瘤的免疫应答中被认为起着至关重要的作用,同时TILs在胃癌中的预后意义取决于TILs的密度和类型。调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)是一种在免疫逃逸中起主要作用的免疫抑制性T淋巴细胞，其能抑制免疫系统抗肿瘤的反应，从而促进肿瘤的生长和侵袭[5]。FOXP3是一种调节Treg发育的转录因子，被认为是Treg的标志物。然而，最近的研究表明，FOXP3不能用作Treg的可靠标记，且效应T细胞在活化后也会上调FOXP3的表达。糖蛋白A为主重复序列(glycoprotein A repetitions predominant，GARP)仅在活化的Treg中选择性表达，而不在活化的效应T细胞中选择性表达[6]，表明GARP对Treg进一步分类标记的靶标[7]。本研究旨在探讨GARP+Treg在胃癌中的及其与临床特征及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年1月至2015年6月因胃癌于我院行手术治疗患者共124例，纳入标准：(1)经病理确诊为胃癌的患者；(2)临床资料完整；(3)病理资料完整；(4)获得完整随访的患者。排除合并机体免疫性疾病或失访的患者。本研究经本院医学伦理委员会评估审核批准。124例胃癌患者中男69例，女55例，年龄34～83岁，平均(54.2±8.3)岁，其中TNM分期为Ⅰ期23例，Ⅱ期65例，Ⅲ期25例，Ⅳ期11例。

1.2 免疫组化 本研究中使用常规的链霉亲和素过氧化物酶免疫组织化学(IHC)染色方案进行。将石蜡包埋的胃癌组织块用莱卡切片机切成4 μm厚的蜡片，每例用防脱载玻片捞片2张，分开两组装架，每组有相同病例载玻片124片，然后将其放进70℃烤箱烤片60 min后，用二甲苯脱蜡并过梯度酒精至蒸馏水。用1%过氧化氢处理组织切片10 min以阻断内源性组织过氧化物酶，随后用牛血清处理30 min以减少非特异性结合。然后，使用柠檬酸盐缓冲液(pH=6.0)进行抗原修复，具体步骤如下：高热微波处理5 min，接着低热微波处理20 min。组一的所有载玻片滴加兔抗人FOXP3单克隆抗体(#12653,1∶200稀释;CST公司)作为Treg的标记，组二载玻片滴加兔抗人GARP多克隆抗体(bs-12093R,1∶200稀释度，北京博奥森)，两组载玻片均一抗4℃下过夜孵育，然后用生物素标记二抗孵育1 h后，所有载玻片用磷酸盐缓冲液(pH=7.4的PBS)冲洗，用3,3′-二氨基联苯胺底物试剂盒显色，然后用苏木精复染载玻片。

1.3 免疫组化评估方法 由2位临床病理医师采用奥林巴斯(BX53)显微镜下对切片进行评估，结果取平均值。用FOXP3和GARP抗体在淋巴细胞中进行细胞质染色被定义为阳性。每切片由临床病理师随机选5个高倍视野(×200)，计算平均每个视野FOXP3+Treg和GARP+Treg的阳性细胞数，最后每例切片的结果取2位病理医师的平均值，124例患者的中位FOXP3+Treg和GARP+Treg的阳性细胞数分为低表和高表达组，其中124例患者FOXP3+Treg的中位阳性细胞数为17个/高倍镜；GARP+Treg的中位阳性细胞数为14个/高倍镜。

1.4 临床指标评价 记录所纳入124例胃癌患者的年龄、性别、肿瘤分化情况、浸润深度、TNM分期，是否存在淋巴结转移和远处结转移的情况，对比FOXP3+Treg和GARP+Treg高表达和低表达与各项临床特征的关系，记录所有患者随访的生存情况。

2 结果

2.1 FOXP3+Treg和GARP+Treg在胃癌组织中的表达情况 124例胃癌患者的肿瘤组织中平均FOXP3+Treg阳性细胞数为(17.2±7.8)个/高倍镜，而平均GARP+Treg阳性细胞数为(13.9±5.3)个/高倍镜，胃癌组织中FOXP3+Treg阳性细胞数显著高于GARP+Treg，差异有统计学意义(t=3.897,P<0.001)，见图1。

A：胃癌FOXP3+ Treg低表达；B：FOXP3+ Treg在胃癌组织中高表达；C：GARP+ Treg在胃癌组织低表达；D：GARP+Treg在胃癌组织中高表达

图1FOXP3+Treg和GARP+Treg在胃癌组织中的表达情况(免疫组化，×200)

2.2 FOXP3+Treg和GARP+Treg在胃癌中的表达与临床特征的关系 FOXP3+ Treg和GARP+Treg与胃癌患者的性别、年龄、分化程度没有显著的相关性(P>0.05)，而TNM分期中Ⅲ～Ⅳ期和淋巴结转移的FOXP3+Treg和GARP+Treg高表达患者比例显著增高(P<0.05)，FOXP3+Treg和GARP+Treg的表达比例具有显著的相关性(P<0.001)，见表1。

2.3 FOXP3+Treg和GARP+Treg对胃癌预后的影响 124例胃癌患者随访时间为6～47个月，中位随访时间为35个月， 其中FOXP3+Treg高表达的患者其总体生存率显著低于FOXP3+Treg低表达的患者，差异有统计学意义(HR=2.228，95%CI：1.070～4.638，P=0.032)；且GARP+Treg高表达的患者其总体生存率显著低于GARP+Treg低表达的患者，差异有统计学意义(HR=3.152，95%CI：1.514～6.566，P=0.002)。见图2。

表1 FOXP3+Treg和GARP+Treg在胃癌中的表达与临床特征的关系 例

A:FOXP3; B:GARP

3 讨论

研究表明存在许多表面和细胞内分子在Treg中高度表达，也有一些分子在Treg上表现出低或负表达[8]。由于目前Treg的可靠标记物仍然有限，所以在免疫治疗中对Treg的表达监测仍然具有障碍[9]。GARP是由662个氨基酸组成的跨膜蛋白。高度表面活化的Treg上GARP的表达显著增加，并增加Treg的抑制功能。此外，GARP可以与潜在的转化生长因子-β(TGF-β)结合，从而促进TGF-β的分泌和活化[9]。TGF-β对Treg的稳态和功能起着决定性的作用。目前Treg的主要标记物为FOXP3，已有研究[10]表明FOXP3+Treg在肿瘤组织周围的积聚可通过其在许多癌症中的免疫抑制功能促进肿瘤生长或明显转移。既往研究[11]表明，Treg对化疗敏感，化疗的抗肿瘤活性导致Treg的消耗，从而影响FOXP3+Treg数量减少，除Treg外，FOXP3在非Treg和效应T细胞中均存在表达，因此FOXP3并不是标记Treg的最佳标志物[12]。因此，本研究探讨GARP+Treg在胃癌中的表达与临床特征及预后的关系。

本研究结果发现，TNM分期中Ⅲ～Ⅳ期和淋巴结转移患者的FOXP3+Treg和GARP+Treg高表达患者比例均显著增高，进一步显示了FOXP3+Treg和GARP+Treg的表达具有显著的相关性。表明了采用GARP对Treg进行标记具有良好的标记效果。目前研究[13]显示GARP和Foxp3之间的关系仍在争论中。Foxp3的表达对于GARP的表达似乎不是必需的，因为在Treg中沉默Foxp3的表达后并不显著影响GARP的表达水平[14]。沉默GARP仅减弱Treg抑制活性，也不影响Foxp3的表达。沉默Foxp3不会改变GARP + Treg的抑制功能[15]。Treg中GARP的诱导依赖于Foxp3表达，并且GARP也可以诱导Foxp3表达。此外，在T细胞受体(TCR)激活后，无论Foxp3表达如何，GARP/LAP都在CD4+Helios+T细胞上调节[16]。这些表明GARP和Foxp3的表达可能是独立的。

既往研究[17]显示了GARP在Treg功能中的潜在作用，GARP+Treg分泌更少的IL-2和IFN-γ。GARP+Treg能够分泌大量的TGF-β和IL-10。此外，Treg的抑制功能受到GARP下调的影响。这些结果表明，GARP至少部分增加了Treg的免疫抑制功能，但是GARP介导的Treg抑制机制仍有待进一步研究[18]。本研究结果进一步显示了高表达FOXP3+Treg和GARP+Treg的胃癌患者其预后不良，表明了两种标记都能具有作为潜在靶标的能力，但GARP+Treg高表达更显著，表明GARP+Treg可能更能反映Treg的功能。GARP是活化Treg的潜在TGF-β的受体，并且在活化的FOXP3+Treg中高表达以促进免疫抑制。GARP有效地抑制幼稚CD4+T细胞的增殖和分化为 T效应细胞[19]，证明GARP在Treg成熟和功能中起关键作用。因此，GARP+Treg是晚期胃癌的独立预后因子，也间接证明了GARP+Treg是具有免疫抑制特性的真正Treg。

综上所述， GARP+Treg与胃癌患者的TNM分期中Ⅲ～Ⅳ期和淋巴结转移相关， 胃癌组织中GARP+Treg的高表达是胃癌患者不良预后的风险因素。然而，本研究为单中心研究，样本含量有限，相关结论有待进一步验证。