朱娟， 陈鑫苹， 胡俊杰， 徐卫华， 李晓娟， 马志超， 张继业， 周红桃, 符生苗

1海南大学热带农林学院(海南海口 570228)； 2海南省人民医院医学检验中心、海南省细胞与分子遗传转化医学重点实验室(海南海口 570311)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是由鼻咽上皮细胞引起的头颈部最常见的恶性肿瘤，它也是东亚和东南亚最常见的癌症之一[1]。近年来研究发现NPC的发生与其遗传因素、环境因素及EB病毒感染有关[2-5]。但具体的发病机制研究尚不透彻。现代分子生物学研究认为，恶性肿瘤的发生、发展都与其相关的某些抑癌基因的失活，原癌基因的激活等密切相关。Survivin是迄今发现的最小的IAPs蛋白，属于凋亡抑制因子，凋亡抑制作用最强。在NPC组织中，研究者们发现Survivin基因的mRNA和蛋白质均为高表达。它主要通过抑制细胞凋亡及细胞的有丝分裂过程等来调控细胞的凋亡，并且与NPC患者的预后密切相关[6-7]。PI3K/AKT 信号通路是调节细胞凋亡的一条重要通路。激活的PI3K 经多种途径引起AKT 突变而使细胞失去正常的生理功能，抑制细胞凋亡，诱导肿瘤的发生、发展[8]。在NPC细胞中，信号通路PI3K/AKT多被过度激活。PTEN基因位于10q23.3染色体上，是一种重要的抑癌基因。它主要参与调控DNA修复、细胞周期进程(包括细胞生长、增殖、衰老、凋亡)及基因突变等相关的信号转导途径。抑癌基因 PTEN 对 PI3K/AKT 信号通路的转导产生负调节作用，当PTEN 发生突变或缺失，使其丧失对AKT 的调节能力时，细胞增殖会失去控制，极易向癌变的方向发展[9]。在NPC细胞中，PTEN是多个细胞因子的直接靶点，通过细胞因子自身的表达，来调控PTEN在NPC细胞中对信号通路PI3K/AKT的抑制作用，从而导致NPC的发生与发展[10-12]。基于前期在NPC细胞中对Survivin研究的基础，2017年12月至2018年10月本文通过调节NPC CNE-2细胞内Survivin的表达，检测细胞内信号通路PTEN/PI3K/AKT各因子的mRNA及蛋白水平的变化情况，并且对NPC CNE-2细胞增殖及凋亡的影响，了解NPC发生、发展过程中Survivin是否对信号通路PTEN/PI3K/AKT有直接调控作用，为进一步对NPC早期诊断及预后监测提供新的潜在靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞株 NPC CNE-2细胞购自中国典型培养物保藏中心。

1.2 试剂 胎牛血清(天津灏洋华科生物)；MEM 培养基(gibco)；riboFECT CP 转染试剂盒(锐博生物)；EASYspin Plus 组织/细胞RNA快速提取试剂盒(艾德莱生物)；RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit,ECL-PLUS/Kit和Real-Time PCR反应试剂盒(Thermo)；超级感受态细胞制备试剂盒和UNIQ-500无内毒素质粒大量提取试剂盒(上海生工)；RIPA裂解液和BCA Protein Assay Kit (碧云天)；NP-40裂解液 (上海鼎国生物)。

1.3 siRNA 序列的合成 根据Survivin gene ID：332 和siRNA 的设计原则，由广州锐博生物科技有限公司设计合成siRNA序列：Survivin siRNA Forward：5′-GCAAAGGAAACCAACAAUAUU-3′，Reverse：5′-UAUUGUUGGUUUCCUUUGCUU-3′。

1.4 过表达质粒的构建 过表达质粒由上海吉凯基因化学技术有限公司合成提供。目的基因：BIRC5 (NM_001168)，物种：Human，载体名称：GV230，元件顺序：CMV-MCS-EGFP-SV40-Neomycin，克隆位点：XhoI/KpnI。

1.5 感受态细胞的制备 将大肠杆菌菌种利用平板划线法活化后，挑取单一菌株接种至LB液体培养基中进行增菌培养，37℃摇床振荡培养12 h后按照说明书要求制备感受态细胞。

1.6 质粒的转染及提取 将构建好的含有目的基因的质粒转入感受态细胞后，先在不含抗生素的LB培养基中进行37℃缓慢振荡培养60 min，取适量菌液涂布至与目的质粒抗性相应的LB平板上进行筛选，37℃倒置培养14 h。从LB平板上挑取单个菌落接种于含有抗生素的液体培养基中，37℃振荡培养14 h。按照UNIQ-500无内毒素质粒大量提取试剂盒进行质粒的抽提。

1.7 细胞培养 CNE-2 细胞用含 10%胎牛血清的 MEM 培养基，置于 37℃，5% CO2培养箱进行细胞培养和传代。

1.8 实验分组 实验分两大组7小组，第一组包括空白对照组，抑制阴性对照组，Survivin抑制组3个小组。CNE-2细胞转染前1 d，消化，制细胞悬液后调节细胞浓度约为 5×105细胞 /mL，并接种于 6 孔板中。次日 CNE-2 细胞融合度达到 60%～80%时，按 ribo FECTTM CP 转染试剂盒说明书进行转染。第二组包括空白对照组，过表达阴性对照组，脂质体组(Lipofectamine 2000)，Survivin过表达组(Lipofectamine 2000+质粒)4个小组。转染前1 d，消化，制备细胞悬液，调节细胞浓度为1×105细胞/mL并接种于6 孔板中。次日细胞融合度达到60%～80%时，按Lipofectamine 2000使用说明书进行转染。

1.9 CCK8检测细胞活性 实验分两大组7小组，每一小组均准备6块6孔板进行转染。第一组(空白对照组，抑制阴性对照组，Survivin抑制组)转染步骤同上第一组。第二组(空白对照组，脂质体组，过表达阴性对照组，Survivin过表达组)转染步骤同上第二组。转染后，细胞培养到12、24、36、48、60、72 h时分别对其中一个6孔板进行消化，制备细胞悬液，接种于96孔板中。将培养板放在培养箱中预培养(37℃，5%CO2),12 h时每孔加入10 μL CCK溶液再孵育2 h，用酶标仪测定450 nm处的吸光度值。

1.10 RT-PCR检测Survivin、PI3K、PTEN、AKT利用EASYspin Plus 组织/细胞RNA快速提取试剂盒提取

细胞总RNA，按RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit进行反转录，合成cDNA。采用PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix进行RT-PCR检测细胞中Survivin、PI3K、PTEN、AKT各组 mRNA的表达。

1.11 Western blot 分析 提取物经PBS洗涤两次后，适量预冷的2×Lysis Buffer裂解，细胞刮刮下细胞转移入EP管中，冰上裂解10～15 min后超声破碎细胞，4℃ 12 000×g离心15 min，取上清用BCA法测定蛋白浓度。调整每个样品蛋白浓度为2 μg/μL进行sps-page 电泳。电泳结束后在4℃ 300 mA恒流条件下电转150 min，将蛋白转移到PVDF膜上进行抗体杂交，经一抗、二抗孵育后X光显影进行分析。

1.2 统计学方法 采用SPSS 16.0 统计软件进行单因素方差分析，采用LSD方法进行两两比较，P<0.05 为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 质粒构建完成 将目的基因转化到感受态细胞后，进行菌落PCR鉴定重组克隆(图1)，将鉴定出的阳性克隆转化子接种于适量含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养12～16 h，取适量菌液进行测序。对测序结果与目的基因序列进行比对分析。比对结果说明：测序结果与目标序列完全一致。见图2。

1：阴性对照组(ddH2O)；2：阴性对照组(空载自连对照组)；3：阳性对照组(GAPDH)；4：Marker自上而下依次为5 kb，3 kb，2 kb，1.5 kb，1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp；5～12:1～8号转化子

图1PCR鉴定重组克隆鉴定

2.2 CCK8检测细胞活性 抑制组细胞生长速度明显下降，过表达组细胞生长速度明显上升，阴性对照组，脂质体组与空白对照组相比差异无统计学意义。见图3。

图2 质粒构建测序图

CON：空白对照组;NC-KD：抑制组阴性对照;KD：抑制组;NC-OE：过表达组阴性对照 OE：过表达组

图3细胞各时间段的活性曲线

2.3 CNE-2细胞中Survivin、PI3K、PTEN、AKT 各mRNA的表达 RT-PCR结果显示，Survivin抑制组的mRNA表达较空白对照组mRNA相对表达量明显下降(P<0.05)、PI3K(P<0.05)、AKT(P<0.05)， 与PTEN mRNA 的相对表达量差异不显著(P>0.05)；Survivin过表达组mRNA表达较空白对照组mRNA相对表达量明显增高(P<0.05)、AKT(P<0.05)，与PI3K和PTEN各mRNA的相对表达量无明显差异(P>0.05)。Survivin抑制组与空白对照组和阴性对照组比较Survivin mRNA 表达抑制率为(41.9±6.9)%(P<0.01)，PI3K mRNA 表达抑制率为(43.3±7.2)%(P<0.01)，AKT mRNA 表达抑制率为(38.7±4.1)%(P<0.01)，PTEN mRNA表达抑制率无统计学意义；Survivin过表达组Survivin mRNA 过表达率为(203.8±17.1)%(P<0.01)，AKT mRNA 过表达率为(239.0±34.2)%(P<0.01)，PTEN mRNA和PI3K mRNA表达抑制率无统计学意义。各组Survivin、PTEN、PI3K、AKT mRNA 相对表达量见表1～3。

组别Survivin mRNA空白对照组1.129±0.206阴性对照组1.103±0.166Survivin抑制组0.419±0.069∗

*与空白对照组比较P<0.01

组别Survivin mRNA空白对照组1.086±0.073阴性对照组1.081±0.214空载体转染组0.953±0.274Survivin过表达组2.038±0.171∗

*与空白对照组比较P<0.01

2.4 CNE-2 细胞中 Survivin、PI3K、PTEN、AKT、p-AKT各蛋白表达情况 Western blot 与灰度分析，用NC校正后的相对结果发现Survivin抑制组的Survivin、PTEN、p-AKT蛋白表达水平较空白对照与阴性对照无明显差异,Survivin、PI3K、AKT蛋白水平较空白对照组与阴性对照组明显下降；Survivin过表达组，PTEN、PI3K、p-AKT蛋白表达水平较空白对照组与阴性对照组无明显差异，Survivin、AKT蛋白水平较空白对照组与阴性对照组，明显上升。各组Survivin、PTEN、PI3K、AKT、p-AKT Western bolt结果灰度分析见表4、图4～7。

组别PTEN mRNAPI3K mRNAAKT mRNA空白对照组1.005±0.0350.950±0.0750.930±0.061阴性对照组(抑制组)1.058±0.0450.873±0.0841.192±0.192Survivin抑制组1.139±0.1520.433±0.072∗0.387±0.041∗阴性对照(过表达组)1.017±0.0991.232±0.1791.038±0.280Survivin过表达组0.947±0.2030.975±0.0312.390±0.342∗

*与空白对照组比较P<0.01

表4 用NC校正的各组相对定量结果

CON：空白对照组;NC-KD：抑制组阴性对照;KD：抑制组;NC-OE：过表达组阴性对照;OE：过表达组

3 讨论

NPC是最常见的头颈部恶性肿瘤，其发病率位居头颈部肿瘤之首，死亡率也居于前列[13]。流行病学数据显示，2012年全球范围内NPC新发病例数为8.7万人，占当年所有癌症新诊断病例数的 0.6%，估计死亡人数达 5.1万人，占当年所有癌症死亡人数的 0.6%[14]。根据我国流行病学数据显示，2013年中国NPC新发病例及死亡病例分别为42 100人、21 320人，分别占当年癌症新发人数及死亡人数的1.14%及 0.96%，初发病率及死亡率分别为 3.09/10 万及 1.57/10 万[15]。NPC还具有种族差异和地域分布差异，其主要发生于东亚、东南亚及北非国家，我国主要分布在广东、广西、海南、湖南和福建五省。Huang等[16]研究发现，NPC发生、发展过程中遗传因素占61.3%，共同环境因素占13.9%，非共同环境因素为24.8%，NPC散发的概率为82.8%。遗传因素致使NPC发生占了很重要的位置。这项研究也说明，NPC的发生、发展是多因素参与的一个动态过程。近年NPC相关基因的研究成为了新的热点，这也为NPC的早期诊断及治疗寻找新的靶点及方法。

CON：空白对照组; NC-KD：抑制组阴性对照; KD：抑制组; NC-OE：过表达组阴性对照; OE：过表达组

图4Survivin、PTEN、PI3K、AKT、p-AKT Western bolt结果

CON：空白对照组;NC-KD：抑制组阴性对照;KD：抑制组;NC-OE：过表达组阴性对照;OE：过表达组

图5用NC矫正Survivin相对定量结果

CON：空白对照组;NC-KD：抑制组阴性对照;KD：抑制组;NC-OE：过表达组阴性对照;OE：过表达组

图6用NC矫正PTEN相对定量结果

CON：空白对照组;NC-KD：抑制组阴性对照;KD：抑制组;NC-OE：过表达组阴性对照;OE：过表达组

图7用NC矫正PI3K相对定量结果

CON：空白对照组;NC-KD：抑制组阴性对照;KD：抑制组;NC-OE：过表达组阴性对照;OE：过表达组

图8用NC矫正AKT相对定量结果

CON：空白对照组;NC-KD：抑制组阴性对照;KD：抑制组;NC-OE：过表达组阴性对照;OE：过表达组

图9用NC矫正p-AKT相对定量结果

Survivin是凋亡抑制蛋白(IAP)家族中的成员之一，是迄今为止发现的最有效的抗凋亡因子[17]。Survivin分子在人胚胎组织和恶性肿瘤细胞中高表达，除胸腺和生殖腺外，在人类正常分化成熟的组织中监测不到Survivin的表达。它参与抑制细胞的凋亡、调控细胞增殖和促进肿瘤血管生成等生理过程，并在多种恶性肿瘤中呈现高表达，与肿瘤进展密切相关[18]。已有文献证实NPC患者的Survivin基因其mRNA和蛋白质在细胞内均过表达[19]。Fu等[20]在此基础上通过RNA干扰技术对NPC细胞CNE-2中的Survivin进行干扰后，Survivin在CNE-2细胞中mRNA和蛋白质表达下降，同时也有效的抑制了CNE-2细胞增殖并诱导其凋亡。陈淑萍等[21]用联合基因Survivin、CDK1 的shRNAs 靶向干扰NPC CNE-2细胞，证实联合基因shRNAs 对Survivin 的表达抑制作用比单基因shRNAs 更强。这一系列的研究证实了Survivin 在NPC的发生、发展过程中起着重要的促进作用，为NPC的早期诊断及预后的监测提供了新的靶点。

PI3K是真核细胞膜的组成部分，是一种能够催化磷脂酰肌醇脂类物质的激酶。它是由一个催化亚基 P110 和一个调节亚基 P85 组成的二聚体激酶。它的蛋白家族对多种细胞调控都发挥着不可替代的作用[22]。PI3K在细胞内外沟通起桥梁的作用，AKT则是细胞内普遍存在的丝/苏氨酸蛋白激酶，它是PI3K/AKT信号转导通路中的关键蛋白。在PI3K/AKT信号通路中，AKT属于中间调控环节，激活和调节许多下游分子目标。AKT能通过抑制细胞凋亡而促进恶性肿瘤的发生[23]。在NPC细胞中，PI3K/AKT信号通路通常是被过度激活的[24]。有研究发现，应用新型的 PI3K/mTOR 双重抑制剂处理NPC细胞及裸鼠移植模型，发现抑制剂不仅在体内外抑制NPC细胞增殖及PI3K/AKT/mTOR 下游信号通路，而且能够引起NPC细胞 G1期阻滞，同时，抑制剂还可以在体内外诱导NPC细胞凋亡[25]。提示PI3K/AKT信号通路是NPC治疗的一个潜在靶点。PTEN是迄今发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，在众多恶性肿瘤中突变及丢失频率很高，PTEN具备促进肿瘤细胞增殖和抑制肿瘤细胞凋亡的双重作用。它是PI3K/AKT 信号通路的负调节器，能够抑制PI3K/AKT的过度表达。其主要的作用是使PI3K底物去磷酸化，通过磷酸化将过量的PIP3 转变为PIP2，抑制AKT 及其下游分子的有效活化，将细胞阻滞在G1期，从而诱导细胞凋亡[26]。Wu等[10]研究证实，PTEN在NPC细胞中是miR-222作用的直接靶点。Zhang等[11]研究证实，PTEN在NPC细胞中是miR-200c作用的直接靶点。上述研究表明，在NPC细胞中，PTEN是多数因子作用的直接靶点，直接影响了NPC细胞的增殖及凋亡。这些研究结果提示PTEN也可作为NPC诊断的一个潜在靶点。

鉴上研究表明，Survivin、 PTEN、 信号通路PI3K/AKT均在NPC发生、发展过程中起着非常重要的作用。在我们前期研究的基础上，本研究利用RNA干扰技术和过表达质粒的构建，将设计的特异性siRNA序列和构建成功的过表达质粒分别对NPC CNE-2细胞进行转染，促使CNE-2细胞内Survivin抑制及Survivin过表达，同时测定细胞内Survivin、PTEN、PI3K、AKT的 mRNA表达和蛋白水平的变化情况，并观察Survivin基因下调和上调分别对人NPC细胞CNE-2生长的影响。我们利用CCK8法对不同组别的细胞活性进行监测发现，Survivin在CNE-2细胞内表达抑制时，CNE-2细胞活性明显下降；Survivin在CNE-2细胞内过表达时，CNE-2细胞活性明显上升。这一结果说明转染特异性siRNA Survivin在CNE-2细胞中被抑制时，能有效促进NPC细胞凋亡，减缓肿瘤细胞的增长；Survivin在CNE-2细胞中过表达时，会促使正常细胞发生、发展,形成无限增殖的肿瘤细胞。在人NPC CNE-2细胞中，Survivin被抑制的同时，我们发现PI3K,AKT mRNA在CNE-2细胞中的相对表达量同时受到了抑制，但只有AKT蛋白表达水平明显下降；Survivin在细胞中过表达的同时，AKT mRNA及蛋白水平在细胞中同时过量表达。这一结果说明，在人NPC CNE-2细胞中Survivin的表达直接影响信号通路中AKT的变化，与其呈正相关，两者变化可直接影响CNE-2细胞的增殖及凋亡，起正协同作用。因此，NPC的发生、发展是由多基因或多因子协同作用的结果，其直接的作用靶点和分子机制有待进一步的研究。