金晓艳， 黄红雨， 赵 虎， 马 宁， 刘 冰

(1昌吉职业技术学院； 2昌吉州中医医院药剂科， 新疆 昌吉 831100； 3新疆医科大学第二附属医院感染管理科， 乌鲁木齐 830063)

铃铛刺[Halimodendronhalodendron(Pall.) Voss]为豆科铃铛刺属种植物，主要生长在我国西北盐碱荒漠地区，铃铛刺花蕾具有较高的营养和药用价值[1]。研究发现铃铛刺花蕾中含多糖、黄酮类、多酚类化合物等活性成分，如炮天雄多糖、金花葵籽多糖、桂七青芒果皮多糖及罗布麻多糖等，具有抗癌、提高机体免疫力、抗疲劳、延缓衰老等功效，临床上多用于肠道疾病的的治疗[2-7]。铃铛刺花蕾已在民间被广泛食用，用于预防保健。本研究采用响应面分析方法，以铃铛刺花蕾提取物中总多糖含量为评价指标，优化提取温度、液料比和提取时间，确定铃铛刺花蕾多糖的最佳提取工艺，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器DH-9070A型电热恒温干燥箱(上海精宏设备有限公司)，SY2000型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)，GL-21M型冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，TU-1800型紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)。

1.2 试剂葡萄糖标准品(国药集团化学试剂有限公司，批号110833-201705)，乙醇(常州恒光化学试剂有限公司，批号20170509)，苯酚(国药集团化学试剂有限公司，批号20171020)，硫酸(常州恒光化学试剂有限公司，批号20160309)，丙酮(国药集团化学试剂有限公司，批号20171020)。

1.3 药材铃铛刺药材2018年5月采摘于昌吉市二六工镇荒滩，经昌吉职业技术学院中药教研室杨卫星高级讲师鉴定为豆科铃铛刺属种植物铃铛刺[Halimodendronhalodendron(Pall.) Voss]的花蕾。

2 方法与结果

2.1 铃铛刺花蕾多糖的提取称取50 g干燥的铃铛刺花蕾研磨，将铃铛刺花蕾粉末与蒸馏水混匀后放入恒温水浴锅，在不同的温度、时间、液料比下进行提取，过滤，将提取液减压浓缩至原体积的1/4，加入95%乙醇，放置12 h后4 000 r/min离心20 min，向沉淀物中加入少许热水，加入95%乙醇放置12 h后离心。沉淀物用无水乙醇、丙酮洗涤至无色，干燥后即得铃铛刺花蕾多糖。

2.2 铃铛刺花蕾多糖含量的测定配置不同浓度梯度的葡萄糖标准品溶液，以多糖质量浓度为横坐标(X)，以吸光度为纵坐标(Y)，进行线性回归，得回归方程为：Y=0.011 3X+0.092 3，R2=0.997。取“2.1”项下铃铛刺花蕾多糖粉末置于50 mL容量瓶，用蒸馏水定容至刻度，吸取2.5 mL溶液置于带塞试管中，采用苯酚-硫酸法，在490 nm处进行比色，计算多糖含量。多糖得率/%=CNV/M×103×100%，式中：C为多糖浓度(mg/mL)；V为定容体积(mL)；N为稀释倍数；M为样品质量(g)。

2.3 单因素实验

2.3.1 提取温度对铃铛刺花蕾多糖提取含量的影响 当液料比为40∶1，提取时间为1 h，以不同的提取温度(40、50、60、70、80℃)进行单因素实验，考察不同提取温度对铃铛刺花蕾多糖提取率的影响。提取温度在40～70℃时，铃铛刺花蕾多糖的得率逐渐增加，当提取温度为70℃时，铃铛刺花蕾多糖提取得率达到最大值为7.68%，因此确定提取温度为70℃，见图1。

图1 提取温度对多糖得率的影响

2.3.2 液料比对多糖得率的影响 当提取温度为70℃，提取时间为1 h，以不同的液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1)mL/g进行单因素实验，考察不同液料比对铃铛刺花蕾多糖提取率的影响。当液料比为40∶1(mL/g)时，铃铛刺花蕾多糖提取得率达到最大值为7.45%，因此确定液料比为40∶1，见图2。

图2 液料比对多糖得率的影响

2.3.3 提取时间对多糖得率的影响 保证液料比为40∶1，提取温度为70℃，以不同的提取时间(1、1.5、2、2.5、3 h)进行单因素实验，考察提取时间对铃铛刺花蕾多糖提取率的影响。当提取时间为2 h时，铃铛刺花蕾多糖提取得率达到最大值为8.05%，因此确定提取时间为2 h,见图3。

2.4 响应面法优化实验设计

2.4.1 响应面设计实验 参考单因素实验结果，根据Design Expert 10 的Box-Behnken 中心组合进行，以提取温度(A)70℃、液料比(B)40∶1(mL/g)、提取时间(C)2 h作为固定因子，对以上3个因素进行响应面分析实验，优化铃铛刺花蕾多糖的最佳提取参数，见表1。

图3 提取时间对多糖得率的影响

表1 响应面设计实验因素水平表

2.4.2 响应面法设计及结果 采用Design-expert 10软件设计铃铛刺花蕾多糖提取的响应面实验，将固定因子设置为提取温度、液料比和提取时间，响应值指标设置为铃铛刺花蕾多糖得率，设计3个水平和3个因素的响应面分析实验方案，以确定铃铛刺花蕾多糖提取条件的最佳值，见表2。

表2 响应面优化的实验方案及结果

2.4.3 多元二次响应面回归模型的建立及显著性分析 使用Design Expert10分析软件对结果进行数据拟合分析，得到拟合全变量二次回归方程：Y=8.55+0.38A+0.36B+0.48C-0.11AB-0.07AC+0.13BC-0.63A2-0.80B2-1.16C2(R2=0.971 5)。本模型的F值为26.54，P值为0.000 1，已经达到高度显著的等级，说明本模型具有显著性；失拟项的P值为0.931 6，不显著，说明所建立模型拟合程度较好。相关系数R2=0.971 5，AdjR2=0.934 9，证明模型的实际值与预测值之间相关性较好。结果表明A、B、C 3个因素对铃铛刺花蕾多糖得率的影响显著，3个因素之间的交互作用AB、AC、BC对最终结果影响不显著，二次项A2、B2、C2对最终结果影响显著。以上结果表明A、B、C是铃铛刺花蕾多糖提取过程中的重要影响因素，各因素之间不存在较大影响；根据数据方差分析结果，3个因素对铃铛刺花蕾多糖得率的影响大小排序为：C>B>A，见表3。

表3 响应面二次模型方差分析

注：*为显著，P<0.05。

2.4.4 根据响应面三维图和等高线图分析因素间的相互作用 响应面优化法是多种参数因素的工艺优化的使用频率较高的方法。通过对响应面图和等高线图的分析能够看出，在最优条件下不同的变量的取值和所产生交互作用。本研究分析了提取温度(A)、液料比(B)、提取时间(C)这3个工艺参数之间的相互作用对铃铛刺花蕾多糖得率所产生的影响。提取温度与液料比之间并不存在较强的交互作用，响应面的峰值位于提取温度的0～1水平和液料比的0～1水平；提取温度与时间之间也并不存在较强的交互作用，响应面的峰值位于提取温度的0～1水平和提取时间的0～1水平；液料比与提取时间之间也并不存在较强的交互作用，响应面的峰值位于液料比的0～1水平和提取时间的0～1水平，见图4-6。

图4 相互作用AB对多糖得率影响的分析图

图5 相互作用AC对多糖得率影响的分析图

图6 相互作用BC对多糖得率影响的分析图

2.5 验证实验验证实验表明铃铛刺花蕾中多糖最佳提取工艺为：提取温度72.7℃，液料比42.2∶1(mL/g)，提取时间2.1 h，预测铃铛刺花蕾多糖得率可达8.70%。在实际操作中将条件调整为：提取温度73℃，液料比42∶1(mL/g)，提取时间2.1 h，按此参数进行实验确认，最终铃铛刺花蕾多糖得率为8.64%，与预测值接近，说明模型能够很好地预测铃铛刺花蕾多糖的实际得率。

3 讨论

铃铛花蕾多糖的提取得率受提取温度、液料比、提取时间的影响。适宜的提取温度能够增加多糖分子的热运动，增加扩散的系数有助于铃铛刺花蕾多糖的浸出[8-9]；不同的液料比能够增加多糖和蒸馏水之间的浓度梯度[10-11]；最适的提取时间能够提升多糖的渗透和溶解速率[12-15]。本研究通过优化提取温度、液料比、提取时间3个影响因素，提升铃铛花蕾多糖的提取得率，经优化后的提取工艺成本降低、耗能减少、稳定性增强，适用于铃铛花蕾中多糖的提取。