李香梅， 卡地尔·依米提， 宋 宁， 黄光楠， 刘 芬， 李晓梅， 杨毅宁

(1新疆医科大学第一附属医院干部保健中心， 乌鲁木齐 830054； 2和田地区人民医院心内二科， 新疆 和田 848000；3新疆医科大学第一附属医院心脏中心， 乌鲁木齐 830054； 4新疆维吾尔自治区人民医院， 乌鲁木齐 830001)

心血管疾病目前已成为人类生存健康的重大威胁[1-2]。稳定型心绞痛是冠状动脉粥样硬化性心脏病的一种临床表现形式，发病机制是动脉粥样硬化。研究表明，动脉粥样硬化是对动脉壁胆固醇积累的一种慢性炎症反应[3]。近年来，长链非编码RNA (long noncoding RNA, lncRNA)已逐渐成为心血管疾病的研究热点之一。LncRNA是一类长度从200 nt～100 kb的非编码RNA分子，没有蛋白编码能力[4]。它们通过不同机制在心肌梗死、心力衰竭等疾病的发病过程中发挥作用[5-6]。现有研究表明，Bvrt、Fendrr、ANRIL、MIAT、LIPCAR、MyHeart 等lncRNA在心肌梗死、心肌病、心力衰竭、动脉粥样硬化等心血管疾病的发生和发展中均发挥重要作用[5,7-12]。除此以外，lncRNA在不同的病理状态下可出现差异性表达，满足作为生物标志物和治疗靶点的条件[5]。

本课题组在前期lncRNA高通量芯片测试分析中发现，较正常对照人群相比，稳定型心绞痛患者外周血中lncRNA ENST00000589524.1表达水平上调，功能富集分析结果表明，该lncRNA与心血管疾病、细胞因子受体活性和氧化应激相关。故本研究就lncRNA ENST00000589524.1在稳定型心绞痛患者中差异性表达进行分析。

1 方法和材料

1.1 研究对象研究对象均来自2014年11月-2015年6月在新疆医科大学第一附属医院心脏中心住院患者，其中稳定型心绞痛患者38例，健康对照人群38例，年龄20～75岁。病例组入选标准：心绞痛症状稳定≥3个月，经冠脉造影证实，至少有一支冠状动脉主支血管狭窄≥50%，血清学检查中心肌梗死标志物(肌酸激酶、肌钙蛋白)阴性。对照组纳入标准：经冠状动脉造影检查，无冠状动脉狭窄。研究对象均排除心肌梗死、脑梗死、肾功能衰竭、结缔组织病、淀粉样病变、严重外伤、肿瘤等疾病。本研究符合赫尔辛基宣言要求，研究方案经新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准。

1.2 外周血单核细胞分离所有入选者在冠脉造影术后30 min内使用EDTA抗凝采血管采集静脉血2 mL，静置于4℃冰箱冷藏30 min，再立即使用低温高速离心机(Beckmna Cuoetlr公司，美国)梯度离心，移除血浆后加入淋巴细胞分离液4 mL(Sigma Diagnostics公司，美国)混匀再次离心，获得分离的细胞。根据说明书使用Trizol法提取总RNA，应用分光光度计(Thermo scientific公司，美国)测定总RNA的浓度及纯度。若测定RNA OD260 与OD280 的比值在1.8～2.0之间，说明所提取的RNA蛋白污染较少，可用于逆转录反应。

1.3 LncRNA ENST00000589524.1的反转录及测定吸取2 μg RNA，按照第一链合成试剂盒(TIAN GEN BIOTECH)说明书配置反应体系，反转录得到cDNA。应用POWER SYBR-GREEN试剂盒配置反应体系，引物由上海生工生物工程公司合成，使用实时荧光PCR仪(Applied Bio Systems公司美国)扩增并检测。扩增条件：95℃预变性10 min，95℃，15 s；60℃，60 s；共40个循环。ENST00000589524.1的相对表达量根据内参基因(β-actin)进行标准化计算。采用2-△△Ct法：ΔCt=Ct(ENST00000589524.1)-Ct(β-actin); ΔΔCt=ΔCt(病例组)-ΔCt(对照组)。β-actin上游引物：CGGGGATGGGGAAAGAACAG,下游引物：GCTGTCACCTTCACCGTTCC。ENST00000589524.1 上游引物：CGGGGATGGGGAAAGAACAG，下游引物: CCCAGGCCCAGTTAGAAACTT。

1.4 临床资料收集及Gensin评分通过问卷调查及查体获得研究对象的基本临床资料，包括患者一般信息、既往病史、吸烟、饮酒史、身高、体质量、心率、血压等。血液生化指标由新疆医科大学第一附属医院检验中心进行测定，包括甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、血清葡萄糖、血尿酸、凝血相关指标、肌酸激酶、肌钙蛋白等。Gensin评分是根据狭窄冠状动脉段数和管腔狭窄程度评价冠状动脉狭窄程度的评分方法。评分由2名医师分别进行计算，二者均不知晓实验数据，最终计算平均得分。

2 结果

2.1 病例组及对照组间临床资料比较研究共纳入38例稳定型心绞痛患者及38例正常对照，2组间临床资料及血液检查指标对比见表1。其中收缩压、高血压病及空腹血糖差异具有统计学意义(P<0.05)，性别、年龄、吸烟、饮酒、体质指数、血脂和射血分数等指标无统计学差异(P>0.05)，见表1。

表1 心绞痛组及对照组间临床资料比较

2.2 外周血ENST00000589524.1表达外周血中ENST00000589524.1表达测定显示，稳定型心绞痛组ENST00000589524.1表达较正常对照组明显增高，差异具有统计学意义，见图1。

2.3 外周血 ENST00000589524.1表达与冠脉病变严重程度的相关性分析为进一步研究外周血ENST00000589524.1表达水平是否与冠状动脉严重程度相关，研究中对心绞痛人群进行了亚组分析(n=38)，以Gensini评分评估冠状动脉狭窄的严重程度。病例组患者根据Gensini评分分成2组: 低危组(Gensini评分≤11分，n=12)，中高危组(Gensini评分>11分，n=26)。分析各组ENST00000589524.1表达水平。结果表明，中高危组患者外周血的ENST00000589524.1表达高于低危组，差异具有统计学意义(P=0.044)，见图2。

图1 外周血ENST00000589524.1表达

图2 不同Gensini 评分组外周血ENST00000589524.1 表达水平

2.4 稳定型心绞痛危险因素多因素Logistic回归分析利用多因素Logistic回归分析冠心病相关危险因素，高血压及ENST00000589524.1高表达是稳定型心绞痛的危险因素，ENST00000589524.1高表达人群患稳定型心绞痛风险增高0.31倍(OR=1.31, 95%CI=1.04～1.65)。

表2 ENST00000589524.1与稳定型心绞痛风险性关系

3 讨论

近年来，lncRNA已成为心血管疾病的研究热点。其特点是长度>200 nt的非蛋白编码转录本，从而与短链非编码RNA区别开来[13]。目前的研究表明外周血中lncRNAs有望成为新的心脏病生物标志物[14]。动物实验表明，急性心力衰竭小鼠模型中，心肌组织中有518个lncRNAs表达上调，另有908个lncRNAs表达下调，与全血或血浆相比，基因表达在心脏组织中发生了显著变化[15]。另有研究显示LIPCAR在心力衰竭的发生发展中起到重要作用[5]，UCA1与急性心肌梗死密切相关[16]。血浆LIPCAR可预测心肌梗死后心室重构，作为心血管疾病死亡的预测指标[17]。ANRIL和KCNQ1OT1可作为左室功能的预后指标[6]。然而，lncRNA是否能成为稳定型心绞痛生物标志物，目前研究尚不明确。

本研究测定了稳定型心绞痛患者及正常对照人群外周血中ENST00000589524.1，与对照组相比，外周血ENST00000589524.1在稳定型心绞痛患者中表达明显上调。这种显著差异提示ENST00000589524.1可能成为稳定型心绞痛潜在的生物标志物。ENST00000589524.1的表达水平与心脏冠脉病变严重程度进行相关性分析，结果显示Gensini 中高危组患者ENST00000589524.1表达水平上调。多因素Logistic回归分析提示ENST00000589524.1高表达人群患稳定型心绞痛风险增高0.31倍。研究表明lncRNA可以调节炎症因子水平的转录，增强了炎症细胞因子的表达，加速动脉粥样硬化的发生发展，从而使得ENST00000589524.1在病例组表达上调，并且与冠脉病变的严重程度相关。以上结果显示ENST00000589524.1差异性表达可能作为稳定型心绞痛生物标志物的研究靶点。然而，通过分子机制探讨ENST00000589524.1对炎症的调节作用需要在细胞或动物实验中进一步探索。

但本研究中也存在几点局限，首先，本研究为单中心研究，且纳入样本量较小。因此，本研究结果可能存在系统误差，需要大样本的多中心研究进一步验证ENST00000589524.1能否成为稳定型心绞痛的潜在标志物。其次，lncRNA通过多种机制对生物过程发挥综合作用，本研究未能阐明ENST00000589524.1在SAP患者中升高水平的机制。最后，本研究未进行药物影响的研究。例如，阿司匹林对长链非编码RNA的影响[18]。

本研究结果表明，稳定型心绞痛患者外周血 ENST00000589524.1表达显著增加，可能是潜在的诊断及预测稳定型心绞痛的循环标记物，为临床诊断提供新的思路和证据。由于其临床样本例数有限，在后续的研究中将继续在扩大临床样本的基础上验证ENST00000589524.1表达水平，同时在细胞及动物水平上通过分子生物学实验进一步明确其具体机制。