刘 淼, 范平生, 张腾跃, 黄 金, 樊高飞, 刘亚贝

(安徽省肿瘤医院, 中国科学技术大学附属第一医院,中国科学技术大学 生命科学与医学部, 安徽 合肥, 230000)

目前，早期肺癌仍缺乏有效的诊断手段，大多数肺癌患者初诊时已为中、晚期，错过了根治性治疗的机会[1]。采用靶向治疗、化学治疗、放射治疗、免疫治疗等手段能使肺癌患者获益，但仍有许多无靶向治疗指征的肺癌患者因肿瘤耐药性的产生而对化疗不敏感，最终导致肺癌治疗失败。多年来，本课题组通过改善维拉帕米给药途径而显著提高了晚期肺癌在内的多种实体肿瘤的治疗疗效，但具体机制尚不完全明确[2-4]。本课题组发现在肺腺癌细胞中，维拉帕米可以有效逆转顺铂耐药，并发现钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)参与维拉帕米逆转肺腺癌细胞耐药的过程，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般材料

肺腺癌细胞株A549购自中国科学院细胞库; 胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、DMEM培养基购自GIBCO公司; CCK-8试剂盒、Annexin V-FITC/PI试剂盒购自碧云天生物技术公司, CaMKⅡ及P-CaMKⅡ抗体购自Abcam公司; HRP二抗和β-actin抗体购自Sigma公司，顺铂(DDP, 江苏豪森, 30 mg/支)及维拉帕米(verapamil, 上海禾丰制药, 5 mg, 2 mL)购自安徽省肿瘤医院。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养: 肺腺癌细胞A549培养于含10%胎牛血清的DMEM完全培养基(含青霉素G钠和链霉素各100 U/mL), 37 ℃、5% CO2培养箱中培养。用0.25%胰蛋白酶消化细胞，进行传代或接种于孔板培养。

1.2.2 Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测细胞增殖: 取对数生长的A549接种到96孔板，约1×104细胞/孔，细胞贴壁后进行药物处理。实验分为正常组、维拉帕米组、顺铂单药组(DDP)、顺铂联合维拉帕米组(DDP+VER)。维拉帕米药物浓度4.91 μg/mL, 顺铂浓度1.00 μg/mL。每组设置3个复孔，并设阴性对照，药物作用48 h后加入CCK-8试剂(10.00 μL/孔)，作用1 h后用酶标仪进行检测(Bio-Rad680)。药物对细胞的抑制率(IR)=(OD空白-OD实验)/OD空白×100%, OD为吸光度值。

1.2.3 Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡: 取对数生长的A549细胞接种于6孔板，药物分组及浓度同1.2.2内容。药物作用48 h后收集各组细胞重悬于500.00 μL的Binding Buffer中，依次加入Annexin V-FITC 5.00 μL和 PI 5.00 μL, 室温避光孵育，流式细胞仪上机检测(参照碧云天生物公司Annexin V-FITC/PI双染试剂盒说明书)。

1.2.4 Western blotting检测蛋白表达水平: 药物分组及浓度同1.2.2内容。将培养板内培养基弃去，冰PBS清洗后再次弃去，加入细胞裂解液于冰上裂解，充分刮离细胞并移入EP管内，置于100 ℃金属浴锅内10 min, 以标准血清蛋白为标准品测定蛋白浓度。使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，半干转至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜), 5%脱脂奶粉室温封闭 1 h, 加入一抗(稀释比例: β-actin为1∶4 000; CaMKⅡ及P-CaMKⅡ为1∶1 000), 4 ℃孵育过夜, PBST洗涤后加二抗(1∶1 000)温育2 h, 加 ECL于化学发光成像系统(ChemiScope 3600 Mini)进行成像。

1.3 统计学处理

应用SPSS 19.0进行数据的统计学分析，计量资料采用均数±标准差表示，比较采用独立样本t检验;P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 维拉帕米逆转肺腺癌细胞顺铂化疗耐药的效果

A549细胞系在单药阿霉素组、阿霉素联合维拉帕米组中的抑制率分别为(55.00±2.60)%和(32.30±1.80)%, 差异有统计学意义(P<0.05)。2组与对照组相比均有显著差异(P<0.05)。见图1。

NC为正常组, VER为维拉帕米组, DDP为顺铂单药组, DDP+VER为顺铂联合维拉帕米组。与DDP+VER比较, *P<0.05。图1 维拉帕米逆转肺腺癌细胞顺铂化疗耐药的效果

2.2 维拉帕米促进肺腺癌细胞顺铂化疗凋亡

在A549细胞中，单药顺铂的凋亡率为10.30%, 顺铂联合维拉帕米为21.60%, 差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

DDP组

DDP+VER组

图2 维拉帕米促进肺腺癌细胞顺铂化疗凋亡

2.3 Western blotting检测蛋白表达水平

在A549细胞中，顺铂联合维拉帕米组中P-CaMKⅡ/CaMKⅡ的表达明显低于单药顺铂组。鉴于CaMKⅡ已被证实参与众多肿瘤相关的信号传导通路，作者测定了单药化疗组及联合组中P-CaMKⅡ/CaMKⅡ蛋白活性水平，结果证实联合药物组中P-CaMKⅡ/CaMKⅡ蛋白表达低于化疗单药组。见图3。

NC为正常组, VER为维拉帕米组, DDP为顺铂单药组, DDP+VER为顺铂联合维拉帕米组。图3 各组P-CaMKⅡ、CaMKⅡ、β-actin的表达

3 讨 论

姑息化疗是治疗晚期非小细胞肺癌患者的有效方法。与单纯支持治疗相比，使用含铂类的联合化疗可有效提高生存率，改善生活质量。由于肺癌细胞对化疗药物的天然或继发的耐受性，使得相当部分患者发生严重的不良反应，且未取得实质的治疗效果。目前认为与肿瘤耐药相关的机制主要包括ABC转运蛋白的跨膜转运、细胞解毒能力的增强、DNA损伤修复系统失调及凋亡相关通路受阻等[5]。

维拉帕米可以逆转多种肿瘤细胞对化学药物的耐药性。体外研究[6]发现，维拉帕米有效逆转肿瘤耐药的浓度是6.00～10.00 μmol/L, 但维拉帕米的静脉安全浓度是1.00～2.00 μmoL/L, 超过安全浓度会导致窦性心动过缓、房室传导阻滞等严重的毒副作用。维拉帕米作为钙离子阻滞剂，其静脉应用时有诱发新的心脏疾病的风险。本课题组通过改变维拉帕米的给药途径(动脉介入化疗、腹腔化疗)并与化疗药物联合应用，大大提高临床疗效，且未出现明显的心脏恶性事件，但仍有部分患者疗效欠佳[7-8], 这更加需要了解其逆转耐药的机制，寻找有效的预测分子。

CaMKⅡ是钙信号下游的一种多功能丝/苏氨酸蛋白激酶，存在4种不同基因亚型。Ca2+能与钙调蛋白(CaM)结合，形成的钙调蛋白复合物能够促进钙调蛋白与CaMKⅡ结合，从而使CaMKⅡ构象发生改变，引起酶的活化，调节不同细胞的生长。相关研究[9]表明α和β亚型在神经细胞的发育及功能活性中发挥重要作用，γ亚型在免疫系统尤其是T细胞记忆、CD8+细胞活化中发挥重要的作用[10], 而δ亚型的研究主要集中在调节心肌细胞的稳态和功能[11]。最近研究[12-13]表明, CaMKⅡ活化包括离子通道、激酶、转录因子在内的约40种蛋白质，从而在多种肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭、转移中发挥重要的作用。CaMKⅡ各种亚型在非小细胞肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、骨肉瘤等恶性肿瘤中过表达，且与其临床病理参数密切相关[14-17]。研究[18-19]表明CaMKⅡ能够通过调控肿瘤干细胞的生长及分化，进而在肿瘤复发、治疗抵抗等方面发挥重要的作用。

本研究发现，在A549细胞中，维拉帕米能提高肺癌细胞中顺铂的抗癌能力，其抑制率及促进凋亡能力均显著高于顺铂单药组(P<0.05)。同时，维拉帕米联合顺铂组中P-CaMKⅡ/CaMKⅡ低于顺铂单药组，推测CaMKⅡ参与了维拉帕米逆转化疗耐药的过程，但具体机制仍需进一步的探讨。