廖丹琼， 储利胜， 张建平， 方 燕， 李 琳， 周 青

（1. 浙江中医药大学临床实践教学中心， 浙江 杭州 310053； 2. 浙江中医药大学基础医学院生理学教研室， 浙江 杭州 310053； 3. 浙江中医药大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学教研室， 浙江 杭州 310053）

睡眠疾病可严重影响生活质量， 降低工作效率， 随着生活节奏加快及生活方式改变， 其发病率不断升高， 据报道， 严重失眠症的发生率约为9.38%， 全球27%左右的患者受其困扰[1］。 目前， 临床治疗失眠症的药物主要是化学合成类镇静催眠药， 但长期使用会产生不良反应和依赖性[2］。

酸枣仁为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill. var.spinosa （Bunge） Hu ex H. F. Chow 的干燥成熟种子， 性味甘、 酸、 平， 归肝、 胆、 心经， 具有养心补肝、 宁心安神、敛汗、 生津等功效， 是公认的有效安神药， 所含黄酮类成分斯皮诺素是发挥镇静催眠作用的主要活性物质[3］， 研究表明[4］， 给予大鼠低于睡眠剂量的戊巴比妥后， 斯皮诺素可显著诱发睡眠， 并呈剂量依赖性地增强戊巴比妥诱导睡眠， 缩短睡眠潜伏期， 延长睡眠时间， 但其作用机制尚不清楚。 因此， 本实验采用改良多平台睡眠剥夺法建立失眠模型， 观察酸枣仁有效活性成分斯皮诺素对大鼠下丘脑黑色素浓集激素（MCH） 和食欲素-A （Orexin-A） 表达的影响， 初步探讨该成分改善睡眠的可能作用途径， 为失眠症临床治疗提供高效、 安全的治疗方案。

1 材料

1.1 动物 健康雄性SD 大鼠120 只， 体质量200～250 g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供， 动物生产许可证号SCXK （沪） 2017-0005。

1.2 试药 斯皮诺素（成都克洛玛生物科技有限公司， 批号72063-39-9， 含有量99%）； 地西泮（北京益民药业有限公司， 国药准字H11020897， 2.5 mg／片）； 一抗MCH 山羊（货号SC-14509）、 一抗Orexin-A 山羊 （货号SC-8070）（美国Santa cruz Biotechnology 公司）； 二抗Alexa fluor 488驴抗山羊 （货号705-545-147）、 驴血清 （货号017-000-121） （北京吉比埃生物技术有限公司）； 大鼠MCH ELISA试剂盒（上海江莱生物科技有限公司， 货号JL21041）； 大鼠Orexin-A ELISA 试剂盒（上海远慕生物科技有限公司，货号YM-SZ1838）； RNA 提取试剂（Trizol 试剂盒） （美国Invitrogen 公司， 货号15596018）； β-actin （碧云天生物技术研究所， 货号H015）； RT-PCR 试剂盒（上海美吉生物医药科技有限公司， 货号DPRT-20）。

1.3 仪器 纯水器（2000D 型， 北京长风仪器仪表公司）；倒置相差显微镜（TE2000-S 型， 日本Nikon 公司）； 冰冻切片机（德国Leica 公司）； 实时定量PCR 仪（美国Stratagene 公司）； Multiskan Ascent 酶标仪（美国Thermo 公司）。

2 方法

2.1 造模 采用改良多平台睡眠剥夺法[5］。 将大鼠置于设有水槽平台的睡眠记录箱内， 平台周边注满水， 大鼠在平台上可自行摄食饮水， 并可在平台间活动， 当它们进入睡眠状态时， 由于全身肌肉张力降低后头部触水而惊醒， 共进行睡眠剥夺72 h。

2.2 分组 60 只大鼠按数字表法随机分为对照组、 模型组、 地西泮组、 斯皮诺素组， 每组30 只。 对照组大鼠于模型组相同时间点放入正常环境的睡眠箱（未设置水槽平台） 内常规饲养， 给予生理盐水； 模型组大鼠造模后给予生理盐水； 地西泮组大鼠造模后给予地西泮（0.8 mg／kg），1 次／d； 斯皮诺素组大鼠造模后给予斯皮诺素（15 mg／kg）， 给药组均按10 mL／kg 体积于晚上19： 00 灌胃给药， 对照组、 模型组于同时间点给予等体积生理盐水，连续2 d。

2.3 大鼠下丘脑MCH 阳性反应表达检测 末次给药后4 h， 大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉， 立即断头处死， 取全脑， 脑组织经固定、 蔗糖脱水、 OCT 包埋后切片， 厚度30 μm， 置于PBS 缓冲液中， 4 ℃下保存。 然后， 切片浸入PBS 缓冲液中漂洗， 10%驴血清、 0.3%Triton-X-100 封闭液处理30 min， 加入一抗混合液[含5%驴血清、 0.3%Triton-X-100、 山羊抗MCH （1 ∶2 000） 或Orexin-A （1 ∶2 500）的PBS 缓冲液］， 4 ℃下孵育过夜， 漂洗， 用含5%驴血清、0.3%Triton-X-100、 Alexa Fluor488 驴抗山羊IgG 荧光二抗（1 ∶1 000） 的PBS 缓冲液避光孵育2 h， 漂洗， 裱片， 封片， 荧光显微镜下观察。 再应用多功能真彩病理图像系统，分析各组MCH、 Orexin-A 阳性表达的光密度、 面密度、 阳性细胞数。

2.4 大鼠下丘脑MCH、 Orexin-A mRNA 表达检测 末次给药后4 h， 大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉， 立即断头处死， 取全脑， 冰台上剥离下丘脑组织， Trizol 法提取总RNA， 以RNA 为模板将其逆转录成cDNA； PCR 扩增按照相应试剂盒说明书操作步骤进行， 反应体系为20 μL， 冰上依次加入逆转录产物cDNA 1 μL、 引物1 μL、 TaqMan GEx MASTER Mix 10 μL， 加双蒸水补至20 μL。 以β-actin为内 参， 正 向5′-CGAGCTGTCTTCCCATCCA-3′， 反 向5′-TCACCAACGTAGCTGTCTTTCTG-3′， 扩增基因片段320 bp；MCH 正向5′-ATGAAGCTTTCCGTTGGTA-3′， 反 向5′-CTACACTTCCCAGCAAGGTC-3′， 扩增基因片段175 bp； Orexin-A 正 向 5′-ATTCGGTCTGCCTGTCCC-3′， 反 向 5′-ACCGCAACCGCCTTAGCT-3′， 扩增基因片段215 bp， 扩增条件为95 ℃预变性5 min， 95 ℃反应30 s， 60 ℃反应30 s， 共40个循环。 然后， 扩增产物通过琼脂糖凝胶中电泳， 在凝胶图像扫描系统中检测其吸光度， 分别计算MCH、 Orexin-A吸光度与β-actin 吸光度的比值， 以此表示最终结果。

2.5 大鼠下丘脑MCH、 Orexin-A 水平 将下丘脑组织置于生理盐水中煮5 min， 充分匀浆， 匀浆液置于EP 管中，室 温 下 放 置 2 h， 加 入 NaOH 处 理， 4 ℃下 离 心（3 000 r／min） 10 min， 吸取上清液置于EP 管中备用， 按照ELISA 试剂盒说明书操作步骤检测MCH、 Orexin-A 水平。 将0.1 mL 稀释待测样品加于已包被反应孔中， 37 ℃下温育1 h， 30 倍蒸馏水稀释浓缩， 每孔加入洗涤液， 静置30 s 后弃去， 重复3 次， 拍干， 再加入0.1 mL 酶标抗体， 37 ℃下孵育0.5～1 h， 洗涤， 每孔依次加入显色剂A、B 各50 μL， 轻轻振荡混匀， 37 ℃下避光显色15 min， 再加入终止液50 μL终止反应， 空白孔调零， 450 nm 波长处测定吸光度。

2.6 统计学分析 通过SPSS 17.0 软件进行处理， 数据用s） 表示， 组间比较采用t 检验； 以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 斯皮诺素对MCH 阳性表达的影响 图1 显示， 在大鼠下丘脑外侧区， 4 组均可观察到MCH 阳性表达， 主要位于细胞质和细胞膜， 其中对照组、 地西泮组、 斯皮诺素组较明显， 而模型组呈散在分布， 表达较少。 表1 显示， 与对照组比较， 模型组大鼠下丘脑MCH 阳性表达光密度、 面密度、 细胞数显著减少（P＜0.01）； 与模型组比较， 斯皮诺素组三者显著增加（P＜0.01）。

图1 斯皮诺素对MCH 阳性表达的影响

表1 斯皮诺素对MCH 阳性表达的影响（s， n=10）

表1 斯皮诺素对MCH 阳性表达的影响（s， n=10）

注：与对照组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

组别 光密度／% 面密度／% 阳性细胞数／个对照组 203.52±25.04 277.92±30.36 43.56±5.58模型组 65.41±11.12∗∗ 105.40±15.99∗∗ 22.15±5.43∗∗地西泮组 122.10±15.33## 165.14±19.05## 33.09±5.63##斯皮诺素组 121.43±15.87## 164.03±20.13## 33.03±5.04##

3.2 斯皮诺素对Orexin-A 阳性表达的影响 图2 显示， 在大鼠下丘脑外侧区， 4 组均可观察到Orexin-A 阳性表达，主要位于细胞质和细胞膜， 其中模型组呈密集型分布， 表达增加， 而对照组、 地西泮组、 斯皮诺素组呈散在分布，表达减少。 表2 显示， 与对照组比较， 模型组Orexin-A 阳性表达的光密度、 面密度及细胞数显著增加（P＜0.01）；与模型组比较， 斯皮诺素组三者显著减少（P＜0.01）。

图2 斯皮诺素对Orexin-A 阳性表达的影响

3.3 斯皮诺素对MCH、 Orexin-A mRNA 表达的影响 表3显示， 与对照组比较， 模型组MCH mRNA 表达显著降低，Orexin-A mRNA 表达显著升高（P＜0.01）； 与模型组比较，斯皮诺素组前者mRNA 表达显著升高， 后者mRNA 表达显著降低（P＜0.01）。

表2 斯皮诺素对Orexin-A 阳性表达的影响s， n=10）

表2 斯皮诺素对Orexin-A 阳性表达的影响s， n=10）

注：与对照组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

对照组 404.51±43.09 517.82±53.44 68.61±7.25模型组 613.77±62.33∗∗ 721.89±73.62∗∗ 89.43±9.23∗∗地西泮组 510.57±53.41## 601.55±62.12## 75.04±7.99##斯皮诺素组 508.92±52.65## 599.53±60.68## 73.51±7.85##

表3 斯皮诺素对MCH、 Orexin-A mRNA 表达的影响0）

表3 斯皮诺素对MCH、 Orexin-A mRNA 表达的影响0）

注：与对照组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

对照组 — 0.92±0.12 0.56±0.06模型组 — 0.44±0.08∗∗ 0.91±0.10∗∗地西泮组 0.8 0.72±0.09## 0.82±0.09##斯皮诺素组 15 0.71±0.08## 0.80±0.09##

3.4 斯皮诺素对MCH、 Orexin-A 水平的影响 表4 显示，与对照组比较， 模型组MCH 水平显著降低， Orexin-A 水平显著升高（P＜0.01）； 与模型组比较， 斯皮诺素组前者水平显著升高， 后者水平显著降低（P＜0.01）。

表4 斯皮诺素对MCH、 Orexin-A 水平的影响， n=10）

表4 斯皮诺素对MCH、 Orexin-A 水平的影响， n=10）

注：与对照组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

组别 剂量／（mg·kg-1） MCH ／（pg·mL-1）Orexin-A／（pg·mL-1）对照组 — 30.31±4.40 22.83±2.43模型组 — 18.55±3.44∗∗ 34.66±3.90∗∗地西泮组 0.8 24.03±4.03## 27.71±2.96##斯皮诺素组 15 23.88±3.36## 27.46±2.99##

4 讨论

文献报道， 大鼠预先（注射戊巴比妥24 h 前） 给予对氯苯丙氨酸后， 可明显缩短戊巴比妥诱导的睡眠时间， 延长睡眠潜伏期， 而斯皮诺素能减弱上述失眠效应， 减少睡眠潜伏期， 延长睡眠时间[4］。 李佳虹等[3］利用受体配体结合技术的原理， 结合HPLC、 LC-MS／MS 技术研究酸枣仁中镇静催眠活性成分， 发现斯皮诺素可与地西泮竞争结合脑组织中苯二氮艹卓受体， 可能发挥了类似的镇静催眠作用。由此推测， 斯皮诺素对睡眠剥夺所致失眠发挥了改善作用，但具体作用机制尚不明确。

MCH 神经元主要位于下丘脑外侧区， 少量散在分布于未定带区域， 其所发出的轴突广泛分布于大脑各个区域，如弓状核、 背内侧核、 室旁核、 腹内侧核， 以及下丘脑以外脑区， 如嗅区、 海马、 基底核和中隔、 网状结构等， 可能通过轴突分布作用于上述的脑区或核团， 直接或间接传递信号， 从而发挥功能调节作用[6］。 Blanco-Centurion 等[7］采取光遗传技术激活下丘脑外侧区MCH 神经元， 可显著增加白天自由活动大鼠的非动眼、 动眼睡眠时间； Vetrivelan等[8］采取上述方法在小鼠实验研究中获得相似结果； 王娟等[9］研究表明， 10、 20 mg／kg 斯皮诺素均分别剂量依赖地增加慢波睡眠2.5、 3.1 倍， 减少觉醒量35.9%、 54.6%，但5 mg／kg 时不影响动物的睡眠-觉醒量。 本实验参照既往研究中斯皮诺素用量， 并结合课题组前期预实验结果， 将其终质量浓度设定为15 mg／kg， 然后检测该成分对睡眠剥夺大鼠下丘脑MCH 神经元阳性表达的影响， 发现斯皮诺素对改良多平台睡眠剥夺法所致MCH 神经元低表达具有改善效果。

Orexin 神经元主要位于下丘脑侧下及穹窿周围区， 其所发出兴奋性投射可到除小脑之外的中枢神经系统其他脑区， 尤其以高密度纤维投射至下丘脑以及脑干单胺能神经元， 参与睡眠-觉醒的调节[10］， 其Fos 表达与觉醒呈明显正相关， 而与睡眠呈显著负相关， 激活后可促进和维持觉醒[11］。 本实验发现， 斯皮诺素对改良多平台睡眠剥夺法所致Orexin-A 神经元高表达具有抑制效果。

MCH 是含有48 个氨基酸的神经肽， 哺乳动物中它主要定位于下丘脑外侧区和未定带区， 一些激活睡眠的神经元能表达MCH 物质， 可增加慢波睡眠向快波睡眠转变， 延长快波睡眠持续时间[12］， 同时也是机体能量内稳态系统中调节睡眠的重要调节因子[13］。 本实验发现， 斯皮诺素对改良多平台睡眠剥夺法所致MCH 表达下降有改善作用。

Orexin-A 是由下丘脑Orexin 神经元合成的小分子神经神经肽， 含33 个氨基酸， 序列在哺乳动物中相同， 它可增加觉醒及抑制睡眠， 是觉醒的重要启动子[14］， Thannickal等[15］报道， 发作性睡病患者下丘脑Orexin-A 神经元总体缺失了33%， 其mRNA、 蛋白表达也明显降低。 本实验发现，斯皮诺素对改良多平台睡眠剥夺法所致Orexin-A 表达增加有抑制作用。

Kitka 等[16］认为， Orexin 神经元能轴突投向参与睡眠调控的脑区， 对觉醒起到关键调节作用； MCH 神经元可抑制其周围及下丘脑的Orexin 神经元， 从而促进睡眠发生。结合本实验结果， 推测斯皮诺素可能是通过上调下丘脑MCH 神经元及其递质表达， 再抑制Orexin-A 表达， 从而对睡眠剥夺大鼠起到改善睡眠的效果。

综上所述， 酸枣仁中斯皮诺素（15 mg／kg） 对改良多平台睡眠剥夺法所致大鼠下丘脑MCH 低表达、 Orexin-A 高表达有逆转作用， 提示该成分改善睡眠疾病的可能作用途径， 有望为失眠症的中药治疗开辟新途径。