朱洁，于辉，张磊

(中国人民武装警察部队特色医学中心，天津300162)

胶质母细胞瘤是发生在颅脑的常见恶性肿瘤，预后较差，中位生存期为10～14个月[1]。微小RNA(miRNA)是一类长度15～27 nt的短链非编码RNA，可参与多种肿瘤生物学行为的调控[2]，在包括胶质母细胞瘤在内的多种肿瘤组织中异常表达[3]。miR-377可通过调控信号通路参与多种肿瘤(骨肉瘤、恶性骨髓瘤和原发性肝癌等)的发生发展[4]。然而，尚未见报道miR-377在胶质母细胞瘤细胞中的表达及其对瘤细胞增殖、凋亡及迁移的影响。2018年1～12月，本研究对此作了探讨，并阐明其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 胶质母细胞瘤细胞系A172、U373、U87、U251及正常脑胶质细胞系HEB购自美国ATCC细胞库，组蛋白去乙酰化酶9(HDAC9)、E26转录因子1(ETS-1)及GAPDH一抗均购自美国BD公司，二抗购自武汉博士德生物工程有限公司，RPMI 1640细胞培养液购自北京友康恒业生物科技有限公司，LipofectamineTM3000 Transfection Reagent购自美国Thermo Fisher公司，miR-377 mimics及Scramble均由广州锐博生物科技有限公司合成，cDNA反转录试剂盒购自Thermo Fisher公司，qRT-PCR试剂盒购自上海吉玛制药技术有限公司，荧光定量PCR仪购自美国Thermo Fisher公司。

1.2 细胞培养 A172、U373、U87、U251及HEB细胞均于37 ℃、5% CO2条件下培养于RPMI 1640细胞培养液。取对数生长期细胞用于后续实验。

1.3 细胞内miR-377表达检测 采用qRT-PCR法。取对数生长期细胞，提取细胞总RNA，用反转录法合成cDNA，以β-actin为内参。miR-377正向引物序列5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物序列5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。95 ℃预变性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40个循环。测定细胞的循环阈值，采用2- ΔΔCt法计算细胞内miR-377的相对表达量。

1.4 转染 将对数生长期的U251细胞随机分为miR-377组、miR-CON组及Blank组，分别用LipofectamineTM3000转染miR-377 mimics、Scramble及PBS空白对照。miR-377 mimics序列sence：5′- AGAGGUUGCCCUUGGUGAAUUC-3′、anti-sence：5′-AUUCACCAAGGGCAACCUCUUU-3′；Scramble序列sence：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′、anti-sence：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′，300 nmol/孔。采用qRT-PCR法对转染效率进行检测，方法同1.3。

1.5 细胞增殖能力检测 采用MTT法。分别于转染后0、24、48、72、96 h，收集miR-377组、miR-CON组及Blank组细胞，按200 μL/孔上样，以2×103/孔的标准种植，培养后，每孔加入MTT 20 μL，用DNM-9606酶标仪检测490 nm波长下的吸光度(OD)值，以OD值作为增殖能力的评价指标。

1.6 细胞迁移能力检测 采用细胞划痕实验。转染后24 h，收集miR-377组、miR-CON组及Blank组细胞，将细胞培养至无菌孔板后，分别于划痕即刻和划痕24 h测定划痕面积，计算划痕愈合率，划痕愈合率=(划痕后即刻划痕面积-划痕后24 h划痕面积)/划痕后即刻划痕面积×100%。实验重复3次，取均值。

1.7 细胞内HDAC9、ETS-1蛋白表达检测 采用Western blotting法。转染后24 h，收集miR-377组、miR-CON组及Blank组细胞，裂解变性。条件：浓缩胶80 V 60 min，分离胶100 V 90 min，一抗浓度1∶400，二抗浓度1∶800。以GAPDH作为内参。经电子发光液显影后分析蛋白灰度值，实验重复3次，取均值。目标蛋白相对表达量=目标蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

2 结果

2.1 各细胞中miR-377表达比较 miR-377在A172、U373、U87、U251细胞中相对表达量分别为0.53±0.05、0.47±0.04、0.41±0.03、0.27±0.03，在HEB细胞中的相对表达量为1.04±0.03，miR-377在A172、U373、U87、U251中的相对表达量低于HEB(P均<0.05),U251中最低，将其作为后续实验细胞。

2.2 各组miR-377表达比较 转染24 h，miR-377组、miR-CON组及Blank组中miR-377相对表达量分别为15.29±0.73、1.03±0.04、1.02±0.03。miR-377组miR-377相对表达量高于miR-CON组、Blank组(P均<0.05)，miR-CON组、Blank组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 各组U251细胞增殖能力比较 见表1。

2.4 各组U251细胞凋亡能力比较 转染24 h，miR-377组、miR-CON组及Blank组细胞凋亡率分别为17.56%±1.43%、4.56%±0.43%、4.63%±0.51%，miR-377组细胞凋亡率高于miR-CON组、Blank组(P均<0.05)，miR-CON组与Blank组细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 三组细胞增殖能力比较

注：与miR-CON组比较，*P<0.05；与Blank组比较，#P<0.05。

2.5 各组U251细胞迁移能力比较 miR-377组、miR-CON组及Blank组划痕愈合率分别为30.5%±3.7%、69.1%±7.2%、65.3%±5.1%，miR-377组划痕愈合率低于miR-CON组、Blank组(P均<0.05)，miR-CON组与Blank组划痕愈合率比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.6 各组HDAC9、ETS-1蛋白表达比较 miR-377组、miR-CON组及Blank组HDAC9蛋白相对表达量分别为0.58±0.05、1.05±0.04、0.98±0.03，ETS-1蛋白相对表达量分别为0.42±0.04、1.03±0.03、1.05±0.04。miR-377组HDAC9、ETS-1蛋白相对表达量均低于miR-CON组、Blank组(P均<0.05)，miR-CON组与Blank组HDAC9、ETS-1蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。

3 讨论

目前已发现多种miRNA(miR-221、miR-203、miR-127和miR-34c等)在胶质母细胞瘤发生发展中发挥重要作用[5,6]。在神经胶质瘤组织中，miR-377低表达，通过靶向调控特异性β1糖蛋白促进癌细胞增殖和侵袭[7]。在前列腺癌组织中，miR-377低表达，通过靶向卷曲蛋白4调控癌细胞增殖、凋亡和迁移[8]。在肾细胞癌组织中，miR-377低表达，可通过靶向ETS-1抑制癌细胞转移[4]。在肝癌细胞组织中miR-377低表达，通过靶向T细胞淋巴瘤侵袭转移促进癌细胞增殖、侵袭和迁移[4]。本研究中，与正常脑胶质细胞系比较，胶质母细胞瘤细胞系中miR-377表达下调，提示miR-377在胶质母细胞瘤中可能发挥抑癌基因的作用。

增殖和抗凋亡能力的获得是肿瘤细胞的显著特征，涉及多种基因和信号通路的改变[9]。HDAC9属于组蛋白乙酰化酶家族，位于人染色体的7p21位点，全长500 kb左右，该基因表达具有组织特异性，与神经系统疾病及多种肿瘤有关[10]。HDAC9在多种肿瘤组织中异常高表达，在子宫颈癌和急性淋巴白血病组织中，HDAC9发挥类似原癌基因的作用[11]。HDAC9对组蛋白的去乙酰化过程具有调控作用，进而对细胞染色体修饰及基因表达过程发挥作用[12]。研究表明，HDAC9可通过与p53相互作用来调节蛋白的转录活性与稳定性[13]。在骨肉瘤组织中，HDAC9的表达高于正常组织，并通过促进p53降解进而促进癌细胞增殖并抑制细胞凋亡[14]。本研究发现,miR-377对胶质母细胞瘤细胞的HDAC9蛋白表达有抑制作用，过表达miR-377可抑制胶质母细胞瘤细胞增殖，并促进其凋亡。这提示miR-377可通过调节HDAC9表达及相关信号通路，调控胶质母细胞瘤增殖和凋亡。

肿瘤细胞迁移能力的获得与癌症转移密切相关。ETS-1又称为E26转录因子，属于ETS转录因子家族，可参与多种细胞生理和病理过程，并在多种肿瘤组织中高表达[15]。ETS-1具有长约85个氨基酸的DNA结合域，可在核内结合靶基因的启动子或增强子，在转录水平调控基因表达水平[16]。通过与基质金属蛋白酶9(MMP-9)、MMP-2、MMP-13的启动子作用，ETS-1可调节细胞间黏附，促进胞外基质降解及癌细胞迁移，与肿瘤转移密切相关[17]。本研究在胶质母细胞瘤细胞系中miR-377过表达，发现miR-377组划痕愈合率低于miR-CON组。可见miR-377过表达可下调ETS-1蛋白表达。提示miR-377可通过下调ETS-1蛋白表达抑制胶质母细胞瘤细胞迁移。

总之，miR-377过表达可抑制胶质母细胞瘤增殖和迁移，促进其凋亡，其机制可能与下调HDAC9、ETS-1蛋白表达有关。miR-377有望成为潜在的胶质母细胞瘤生物标志物，为胶质母细胞瘤的早期诊断和治疗提供新的方向。本研究也存在不足，miR-377在动物体内的作用目前不知，值得进一步研究。