柯世业，石光耀，刘定辉，2，吴 琳，温仁辉，朱洁明，钱孝贤，2

（中山大学1.附属第三医院心血管内科，2.中西医结合研究所，广东 广州510630）

糖尿病是心血管疾病的危险因素之一，糖尿病患者冠状动脉粥样硬化性心脏病的发病率及病死率是非糖尿病的2.40倍［1］。研究发现高糖明显加速血管内皮细胞衰老，而内皮细胞衰老在冠状动脉粥样硬化等增龄相关性血管疾病的发病中发挥重要作用［2］。因此，预防高糖诱导的内皮细胞衰老将有望成为防治糖尿病相关心血管疾病的一个新的靶点。沉默信息调节因子3（Sirtuin 3，Sirt3）是NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶，其主要位于线粒体内，可调节大部分线粒体蛋白赖氨酸乙酰化［3-4］。研究发现Sirt3能增加超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）活性，提高细胞抗氧化应激能力，Sirt3在心血管疾病的防治中发挥重要作用［5-6］。我们既往研究发现，人参皂苷Rb1能通过抗氧化应激预防过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）衰老［7-8］。但人参皂苷Rb1对高糖诱导的HUVEC衰老的保护作用及其潜在机制尚未见报道。本研究旨在从Sirt3/SOD2通路探讨人参皂苷Rb1延缓高糖诱导的HUVEC衰老的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人参皂苷Rb1购自成都普菲德生物科技有限公司，分子式：C54H92O23，分子量：1109.31，为白色粉末状结晶，高效液相色谱鉴定纯度≥98%；葡萄糖、内皮细胞生长因子（endothelial cell growth supplement，ECGS）购自Sigma-Aldrich；Ⅰ型胶原酶、M199培养基和谷氨酰胺购自Gibco；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自上海吉泰依科赛公司；CCK-8、细胞裂解液、蛋白定量试剂盒（BCA法）和衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase，SA-β-Gal）染色试剂盒购自上海碧云天；Annexin V-FITC/PI染色试剂盒和不含EDTA的2.5 g/L胰蛋白酶购自南京凯基；3-TYP购自美国Selleck公司；抗Ⅰ型抗纤溶酶原激活物抑制剂（plasminogen activator inhibitor 1，PAI-1）、抗Sirt3、抗SOD2、抗P16和抗GAPDH抗体购自Cell Signaling Technology；Ⅱ抗购自武汉博士德；丙二醛（malondialdehyde，MDA）测试盒和SOD活性检测试剂盒购自南京建成。

1.2 细胞分离培养

HUVEC原代分离培养及鉴别参考既往文献报道［9-12］，大致过程如下：取健康无菌新生儿脐带，PBS清洗3次，用1g/LⅠ型胶原酶室温消化15 min，收集的Ⅰ型胶原酶细胞混合液用1 200 r/min（r=17 cm）离心5 min，弃上清后用预温的完全培养基（800 mL/L M199，200 mL/L FBS，20 μg/mL ECGS，1 mmol/L谷氨酰胺）重悬细胞，吹打混匀后种于培养瓶中培养。1-2代细胞用于后续实验。

1.3 CCK-8检测细胞活力

将HUVEC按4×103个细胞／孔接种于96孔板中并培养24 h后，用不同浓度的人参皂苷Rb1（10、20、30、40、50、60和70 μmol/L）预处理细胞1 h，再用40 mmol/L葡萄糖刺激24 h。处理结束后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，用锡箔纸遮盖后将细胞置于37℃下孵育1.5 h。最后使用酶标仪在450 nm测定各孔的吸光度值。

1.4 SA-β-Gal染色

SA-β-Gal染色参考参考既往文献报道［11，13］。大致过程如下：用PBS轻轻清洗细胞2次，5 mL/L戊二醛溶液固定5 min后，每孔加入1 mL染色工作液，用锡箔纸遮盖后将细胞置于37℃下孵育18 h。孵育结束后倒置显微镜下进行计数和拍照，SA-β-Gal染色阳性率计算方法为：连续计数400个细胞，计算出蓝染细胞（即SA-β-Gal染色阳性细胞）数目/400个细胞的百分比。

1.5 Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术

用不含EDTA的2.5 g/L胰蛋白酶消化各实验组的HUVEC，2 000 r/min（r=17 cm）离心5 min收集细胞沉淀，PBS轻轻清洗2遍后，加入500 μL试剂盒缓冲液重悬细胞于流式管中，分别加入Annexin V FITC和PI各5 μL，室温避光染色15 min后，通过流式细胞术分析染色的细胞，每个样品至少收集104个细胞。

1.6 Western blot实验

细胞处理结束后弃去培养基，用预冷的PBS轻轻冲洗2次，加入适量细胞裂解液，冰上充分裂解后用细胞刮刮取细胞蛋白，置于4℃超速离心机1.2×104r/min（r=8 cm）离心10 min后取上清，BCA法测定蛋白含量。总蛋白煮沸5～10 min，SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜上。用50 g/L脱脂奶粉溶液于室温封闭1 h，加入PAI-1、P16、Sirt3、SOD2及GAPDH（均为1∶1 000）I抗4°C摇床孵育过夜。弃去I抗，1×TBST洗5 min／次×3次，加入Ⅱ抗（1∶10 000）于室温孵育1 h；弃去Ⅱ抗，1×TBST洗5 min/次×3次，用化学发光法曝光显影。最后使用Image J软件分析图像。

1.7 MDA含量及SOD2活性的测定

用PBS轻轻清洗细胞2次，加入细胞裂解液并用细胞刮刮取细胞，于4℃1.2×104r/min（r=8 cm）离心10 min后取上清，BCA法测定蛋白含量。分别利用MDA及SOD比色法检测试剂盒检测HUVEC细胞蛋白上清液中的MDA含量及SOD2活性水平。

图1 人参皂苷Rb1对细胞活力的影响Fig.1 The effects of ginsenoside Rb1 on cell viability

1.8 统计学处理

采用SPSS 25.0统计软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差）表示，呈正态分布且方差齐性的数据组间差异性比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），存在差异则采用LSD-t法进行组间两两比较。选取检验水准α=0.05，P＜0.05（双侧）为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度人参皂苷Rb1对内皮细胞活力的影响

HUVEC接种于96孔板，生长24 h后，分别给予 10、20、30、40、50、60 和 70 μmol/L 人参皂苷Rb1。24 h后，CCK-8检测发现，该浓度范围人参皂苷Rb1对内皮细胞的活性均没有影响（图1A）。然后，我们用该浓度范围的人参皂苷Rb1预处理内皮细胞1 h后，相应加入40 mmol/L葡萄糖。培养24 h后，CCK-8结果发现与正常对照组（5 mmol/L葡萄糖处理）相比，高糖组细胞活性降低，而人参皂苷Rb1具有明显的细胞保护作用，其中40 μmol/L人参皂苷Rb1是最有效的人参皂苷Rb1浓度（图1B）。所以，后述的实验就选用40 μmol/L人参皂苷Rb1这一浓度对细胞进行干预。

2.2 人参皂苷Rb1减轻高糖诱导的内皮细胞衰老

HUVEC生长至60%～70%时，先给予40 μmol/L人参皂苷Rb1共同孵育1 h后，相应加入40 mmol/L葡萄糖，继续培养24 h。结果发现人参皂苷Rb1单独干预对PAI-1、P16蛋白表达和SA-β-Gal染色无显著影响；高糖组（HG组）细胞PAI-1、P16蛋白表达增加，SA-β-Gal染色阳性细胞率增加，与正常对照组相比具有显著差异；而40 μmol/L人参皂苷Rb1预处理能显著减少高糖诱导的PAI-1、P16蛋白表达，同时SA-β-Gal染色结果也证实了40 μmol/L人参皂苷Rb1能明显减少SA-β-Gal阳性细胞数目（图2B、C）。另外，Annexin-V/FITC-PI双染流式细胞术结果提示高糖处理第1-2代HUVEC 24 h，各实验组的细胞凋亡没有明显差异（图2A），以排除实验中细胞凋亡效应的影响。

图2 人参皂苷Rb1对高糖诱导的内皮细胞衰老的影响Fig.2 The effects of ginsenoside Rb1 on high glucose（HG）-induced senescence in HUVEC

2.3 人参皂苷Rb1对Sirt3和SOD2蛋白表达的影响

为进一步探索人参皂苷Rb1抗高糖诱导内皮细胞衰老的机制，我们对Sirt3和SOD2的蛋白表达水平进行了检测。Western blot结果提示40 mmol/L葡萄糖诱导的衰老HUVEC内Sirt3和SOD2蛋白表达水平均下降，而人参皂苷Rb1预处理能部分逆转衰老HUVEC内的Sirt3和SOD2蛋白表达水平的减低（图3）。

图3 人参皂苷Rb1对内皮细胞内Sirt3和SOD2蛋白表达的影响Fig.3 The effects of ginsenoside Rb1 on the protein expression of Sirt3 and SOD2 in HUVEC

2.4 人参皂苷Rb1对内皮细胞MDA含量和SOD2活性的影响

SOD2表达减少，直接影响细胞内SOD2活性。与正常对照组相比，衰老的内皮细胞中SOD2的活性明显降低，而人参皂苷Rb1预处理则部分逆转了SOD2活性的降低，同时，与正常对照组相比，衰老细胞中的MDA含量升高，而人参皂苷Rb1预处理则部分降低MDA含量（表1）。

2.5 3-TYP显著抵消人参皂苷Rb1改善内皮细胞衰老的作用

上述结果表明人参皂苷Rb1可能通过调节Sirt3/SOD2信号通路改善高糖诱导的HUVEC衰老。为了进一步验证，我们通过使用16 nmol/L Sirt3特异性抑制剂3-TYP与人参皂苷Rb1同时预处理HUVEC 1 h后，加入40 mmol/L葡萄糖继续培养24 h，通过western blot检测PAI-1和P16衰老蛋白指标研究Sirt3在人参皂苷Rb1中的作用。结果提示HG＋Rb1+3-TYP组Sirt3和SOD2蛋白表达均较HG+Rb1组明显降低（图4A）；且PAI-1和P16蛋白表达均较HG+Rb1显著升高（图4B）。这些结果说明加入Sirt3特异性抑制剂3-TYP后的衰老HUVEC不再受人参皂苷Rb1的保护。

表1 人参皂苷Rb1对内皮细胞MDA含量和SOD2活性的影响Table 1 The effects of ginsenoside Rb1 on MDA content and SOD2 activity in HUVEC

表1 人参皂苷Rb1对内皮细胞MDA含量和SOD2活性的影响Table 1 The effects of ginsenoside Rb1 on MDA content and SOD2 activity in HUVEC

1）P ＜0.001vscontrolgroup；2）P＜ 0.001vsHGgroup by LSD-t test after ANOVA.n=3

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3 讨论

综合上述研究结果，我们发现40 mmol/L葡萄糖可诱导原代HUVEC衰老，而40 μmol/L人参皂苷Rb1通过Sirt3/SOD2信号通路在一定程度延缓高糖诱导的HUVEC衰老。

我国糖尿病发病率约为9.9%，而65～74岁年龄组更是达到14.1%［14］。血管性疾病是糖尿病最常见的并发症，并是糖尿病其他慢性并发症的病理基础。血管内皮功能障碍作为血管性疾病进程中一个早期的关键因素，在糖尿病患者中常可出现；长期的慢性高血糖被认为是导致内皮功能障碍的独立危险因素［15］。因此，利用高糖诱导内皮细胞衰老的早熟性衰老模型模拟糖尿病患者内皮损伤，并探讨相应机制，寻求相关防治方法，能对糖尿病血管性疾病的未来防治策略提供更有效的策略。

图4 抑制Sirt3表达和人参皂苷Rb1处理对SOD2蛋白表达及衰老蛋白表达的影响Fig.4 The effects of 3-TYP and ginsenoside Rb1 on high glucose（HG）-induced protein expression of SIRT3 andSOD2（A），PAI-1 and P16（B）in HUVEC

Sirt3是一种位于线粒体内的去乙酰化酶，它可指导线粒体能量代谢和氧化应激，限制活性氧的积累［16］。由于Sirt3对维持线粒体功能具有重要作用，而线粒体功能障碍是衰老过程的关键环节，因此Sirt3与衰老之间关系密切［17］。Sirt3的激活与延长寿命相关。研究发现Sirt3基因敲除小鼠在第8周出现心肌肥大、纤维化等心脏衰老表现［18］。SOD2是一种特定位于线粒体内的SOD，被认为是抑制线粒体活性氧的清除酶［19］。研究发现Sirt3可以通过上调线粒体内SOD2的表达，提高SOD2的活性，进而提高线粒体清除活性氧能力，抑制衰老及相关疾病的发生［20］。

人参是我国传统的中医药材，有很强的抗疲劳、延缓衰老、提高机体免疫与代谢的功能。人参皂苷Rb1是人参中起药理作用的主要成分之一［21］。我们既往研究表明，人参皂苷Rb1在心血管系统及神经系统中具有保护作用。过氧化氢诱导内皮细胞衰老时，细胞活性氧、MDA水平升高，SOD1表达和活性降低，eNOS表达和NO含量下降，而人参皂苷可通过Sirt1去乙酰化eNOS增加NO含量有效地逆转这些改变［8，22］。在体内实验中，人参皂苷Rb1通过减轻老年C57BL/6小鼠年龄相关性炎症反应和氧化应激水平，促进主动脉组织eNOS/NO表达改善内皮功能［23］；人参皂苷Rb1还能通过mTOR/p70S6K通路改善C57BL/6小鼠脑自然衰老［24］。本研究中发现，CCK-8结果表明40 μmol/L人参皂苷Rb1为逆转40 mmol/L葡萄糖损伤的最有效浓度，在加入40 μmol/L人参皂苷Rb1预处理后，高糖诱导的内皮细胞衰老能被有效地遏制，SA-β-Gal阳性率明显降低，PAI-1及P16作为内皮细胞衰老特异性蛋白标志［25-26］，其表达减少，Sirt3及SOD2表达增多，MDA含量降低，SOD2活性升高，而当加入16 nmol/L Sirt3特异性抑制剂3-TYP后，人参皂苷Rb1的抗衰老作用消失，说明人参皂苷Rb1具有抗高糖诱导内皮细胞衰老的作用，其抗衰老作用可能与人参皂苷Rb1调控Sirt3/SOD2信号通路有关。此研究进一步丰富了人参皂苷Rb1抗内皮细胞衰老的机制。

本研究结果表明人参皂苷Rb1可通过激活Sirt3/SOD2信号通路部分抑制高糖诱导的HUVEC衰老。本课题拓展了我们对于人参皂苷Rb1抗内皮细胞衰老的认识，但仍需在更多的体内研究和临床试验进一步论证，最终用于糖尿病血管性并发症的防治。