张炜琳，王鑫怡，严 方

(中国药科大学药物分析教研室，南京 210009)

蛋白质在催化生化反应、运输营养物质、转导信号和维持细胞机械结构等生物过程中起着关键作用[1]。在真核生物中，蛋白质翻译后通常会被进一步修饰，以调节其结构、活性、亚细胞定位和整体功能等。到目前为止，已有超过400种翻译后修饰类型和8万个以上蛋白质特异翻译后修饰(post-translational protein modification，PTM)位点被报道，包括糖基化、磷酸化、乙酰化、甲基化和泛素化等[2-3]。其中蛋白质糖基化修饰参与多种重要的生物进程，如细胞黏附、信号转导、免疫保护、炎症和代谢调节等[4]，O-GlcNAcylation(O-GlcNAc)糖基化是一种重要的糖基化修饰，在信号转导、表观遗传、应激反应、蛋白质降解和凋亡等生物进程中发挥关键作用[5-9]。

大量研究表明，糖代谢异常会导致胰腺癌、肝癌、乳腺癌、直肠癌和胃癌等肿瘤发病风险增加，与肿瘤的发生发展密切相关[10-11]。蛋白质的O-GlcNAc修饰对肿瘤的异常糖代谢有重要的调控作用，糖代谢途径中的重要激酶，如磷酸果糖激酶1(phosphofructokinase 1，PFK1)[12]、丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2，PKM2)[13]及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)[14]等均受到O-GlcNAc糖基化修饰的动态调控。蛋白质的O-GlcNAc糖基化水平部分反应了生物系统的糖代谢状态[15-16]，与肿瘤葡萄糖摄取、糖酵解和戊糖磷酸途径等糖代谢途径密切相关。本文综合分析了O-GlcNAc糖基化修饰的研究进展，重点讨论了O-GlcNAc糖基化修饰对肿瘤糖代谢方面的调控作用。

1 蛋白质的O-GlcNAc修饰

蛋白质的O-GlcNAc修饰作为一种重要的糖基化修饰类型在人体生理和病理过程中发挥着重要的作用[17-18]。大量研究表明慢性疾病的发病机制与机体的O-GlcNAc内稳态改变有关，如糖尿病细胞中的部分胰岛素信号蛋白和线粒体蛋白上都检测到蛋白质整体O-GlcNAc水平的异常升高[19]，而在阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)患者体内中却发现微管相关蛋白(microtubule-associated proteins，MAPT)的O-GlcNAc水平降低，磷酸化水平增加，进而促进了MAPT寡聚化并导致AD发生[20]。

O-GlcNAc修饰由Torres等[21]于1984年在鼠类淋巴细胞中首次发现，与主要发生在细胞表面和分泌蛋白中的天冬酰胺(N-连接)或丝氨酸/苏氨酸残基(O-连接“黏蛋白型”)“经典”糖基化修饰有所不同，O-GlcNAc修饰是发生在细胞质和细胞核蛋白质的丝氨酸/苏氨酸残基上的单糖修饰，糖型结构相对单一(图1)。O-GlcNAc修饰由O-GlcNAc糖基转移酶(O-GlcNAc transferase，OGT)和O-GlcNAc糖苷酶(O-GlcNAcase，OGA)这两种酶动态调控[22]。O-GlcNAc修饰循环过程如图1所示，OGT催化GlcNAc片段从供体底物乙酰氨基葡萄糖尿苷二磷酸(uridine 5′-diphosphate-N-acetylglucosamine，UDP-GlcNAc)转移至目标丝氨酸或苏氨酸残基的羟基，形成β-O-糖苷键；而OGA催化这种糖修饰的水解，最终实现对蛋白质O-GlcNAc修饰的动态调控[22-23]。细胞内O-GlcNAc糖基化修饰水平随着葡萄糖、游离脂肪酸、尿苷和谷氨酰胺等营养物质的含量变化而发生波动，因此，O-GlcNAc糖基化也被认为是一种敏感的压力和营养感应器，并动态调节细胞转录翻译、信号转导和代谢等多种生命活动，O-GlcNAc修饰平衡的破坏将会导致各种病理疾病，如肿瘤、糖尿病和神经退行性疾病等[19,22,24]。

图1 蛋白质O-GlcNAcylation修饰过程
OGT：O-GlcNAc糖基转移酶；OGA：O-GlcNAc糖苷酶；GlcNAc：N-乙酰葡萄糖胺；UDP：二磷酸尿嘧啶

2 肿瘤的异常糖代谢

从某种程度上来说，肿瘤是一种代谢疾病[25-26]，其发生发展与细胞代谢异常密不可分。糖代谢是生物体能量代谢的重要组成部分，葡萄糖在胞膜葡萄糖转运蛋白(glucose transporter，GLUT)的作用下进入细胞内，通过糖酵解、磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway，PPP)以及三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle，TCA)等途径进行代谢[27]。在氧气充足的情况下，机体主要通过三羧酸循环和氧化磷酸化途径分解代谢葡萄糖；在氧气不足的情况下，可通过糖酵解途径分解代谢葡萄糖，糖酵解途径所产生的腺苷三磷酸(adenosine triphosphate acid，ATP)较氧化磷酸化途径少得多[28-29]。20世纪初，德国生物化学家Warburg等[30]研究发现，肿瘤细胞即使在有氧环境下也主要通过糖酵解途径产生ATP的方式进行葡萄糖代谢，而不是以线粒体氧化磷酸化的方式进行葡萄糖代谢。该代谢方式被称为有氧酵解或者Warburg效应，是肿瘤细胞异质性的一大特征。在增殖活跃的肿瘤细胞中，葡萄糖摄取和糖酵解速率显著增加，细胞依赖糖酵解产能以维持较高水平ATP/ADP及NADPH/NAD+，使其能够适应生存条件的改变并快速增殖，增强肿瘤细胞对恶劣条件的耐受性并获得生长优势[26-29]。

3 蛋白质O-GlcNAc修饰与肿瘤糖代谢异常的关系

3.1 O-GlcNAc糖基化对葡萄糖摄取(glucose uptake)的调控

葡萄糖转运蛋白(GLUT)是一类跨膜蛋白，辅助细胞对葡萄糖进行摄取，目前已发现14个葡萄糖转运蛋白家族成员，根据其同源性以及共同序列的特征可分为3个亚家族：家族1(GLUTs 1-4，14)、家族2(GLUTs 5，7，9，11)及家族3(GLUTs 6，8，10，12，HMIT)[31]。其中GLUT4是葡萄糖摄取过程中的关键蛋白[32]。Buse等[33]首次在小鼠骨骼肌和脂肪的GLUT4上检测到O-GlcNAc修饰，Park等[34]在进一步研究中发现GLUT4的O-GlcNAc修饰影响其在细胞中的定位。其机制可能是GLUT4第57位苏氨酸上O-GlcNAc糖基化修饰通过竞争性阻断该位点上的磷酸化修饰，从而调节其下游信号通路间接改变其定位；或是通过调控微泡蛋白而直接改变GLUT4的定位，进而影响其对葡萄糖摄取。GLUT1作为最广泛表达的葡萄糖转运体之一，在肿瘤细胞中其表达受到缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF-1α)的调控[35]。Ferrer 等[36]发现OGT对GLUT1转录关键因子HIF-1α具有调控作用，OGT表达量增加引起细胞整体O-GlcNAc修饰表达水平上调，使HIF-1α活性增加以促进GLUT1的转录和摄取葡萄糖[36]。此外，与对照组相比，OGT缺失而固醇调节因子结合蛋白1(sterol regulatoryelement binding protein 1，SREBP-1)[37]、HIF-1α[36]和GLUT1[36]以及白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8)[38]过表达的不同种类人源肿瘤细胞的葡萄糖摄取能力增加，代谢率和存活率提高。因此，推测OGT作为O-GlcNAc糖基化修饰过程的关键酶，调控蛋白质的O-GlcNAc糖基化水平，进而影响肿瘤细胞中GLUT1的表达量和活性，在肿瘤发生发展过程中起着重要的作用。

己糖激酶(hexokinase，HK)对多种六碳糖具有磷酸化的作用，可将转运至膜内的葡萄糖磷酸化为带电荷的6-磷酸葡萄糖(glucose-6-phosphate，G-6-P)，使其不再被转运至细胞外(图2)。HK表达量也受到HIF-1α的调控[34,39]，Yi等[40]在质粒转染OGT过表达的293T细胞中发现HK的活性显著增强，推测HK间接受到OGT的调控，其可能的调控机制与Ferrer等[36]发现的OGT对GLUT1调控机制类似。

己糖激酶Ⅳ又称为葡萄糖激酶(glucokinase，GCK)作为调节肝脏葡萄糖含量的关键酶，是维持肝脏葡萄糖稳态的重要感受器[41]。Baldini等[42]在小鼠肝脏中检测到GCK存在O-GlcNAc修饰，进一步小鼠实验发现O-GlcNAc修饰能正反馈调控GCK表达量，破坏肝脏葡萄糖稳态，导致糖尿病及其他疾病的产生。上述研究均表明OGT催化的蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰在葡萄糖代谢的摄取阶段具有重要的调控作用。

3.2 O-GlcNAc糖基化对糖酵解的调控

肿瘤为适应生存条件的变化和快速增殖，以糖酵解途径作为获取能量的主要方式。磷酸果糖激酶1(phosphofructokinase-1，PFK1)作为糖酵解途径的主要调节酶，通过细胞内底物的获得量和营养状态发生变构调节。当PFK1处于激活状态时，催化6-磷酸果糖(fructose-6-phosphate，F-6-P)磷酸化生成1，6-二磷酸果糖(fructose-1,6-bisphosphate，F-1,6-BP)[43]进入糖酵解途径；而当PFK1活性被抑制时，F-6-P就被转换回G-6-P，进入磷酸戊糖途径[44](图2)。而PFK1活性与其O-GlcNAc糖基化修饰密切相关[44]。Yi等[40]在PUGNAC(OGA抑制剂)处理的人源肺癌细胞中发现PFK1的活性明显降低，通过代谢标记和质谱分析方法检测到PFK1的第529位丝氨酸发生O-GlcNAc糖基化修饰。将该位点突变为丙氨酸后与野生型相比，突变型细胞的F-6-P糖基化水平降低，且主要通过糖酵解途径进行葡萄糖代谢，细胞增殖能力明显增加。并且建立了PFK1兔同源模型，发现PFK1的O-GlcNAc糖基化位点S529通过氢键与2，6-二磷酸果糖中的两个磷酸盐相互作用，进一步推测PFK1的S529位点O-GlcNAc糖基化将阻断S529位点与2，6-二磷酸果糖的相互作用，最终抑制2，6-二磷酸果糖变构活化。除此之外，O-GlcNAc糖基化也能抑制PFK1的寡聚化并调节其活性，使糖酵解产物乳酸含量降低，诱导H1299肺癌细胞的细胞生长。以上研究结果表明，PFK1的O-GlcNAc糖基化对肿瘤细胞生长起着关键的调控作用[40]。

丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2，PKM2)是催化糖酵解最终反应的关键酶。Wei等[45]发现该PKM2蛋白第405位苏氨酸和第406为色氨酸上同样存在O-GlcNAc糖基化修饰(图2)。进一步研究发现PKM2的O-GlcNAc糖基化水平在多种类型的人类肿瘤细胞系和肿瘤组织中均上调，且该修饰破坏PKM2四聚体的稳定性，降低四聚体活性，导致PKM2蛋白向核内移位。该研究也证实了PKM2的O-GlcNAc修饰与肿瘤细胞内葡萄糖消耗、乳酸增加、脂质和DNA合成水平提高等肿瘤代谢途径密切相关。这些研究表明PKM2的O-GlcNAc糖基化更有利于葡萄糖进入糖酵解途径进行代谢，促进肿瘤细胞的增殖与转移。

除上述研究外，研究者们在糖酵解过程中的大部分酶上均检测到O-GlcNAc糖基化修饰，如果糖酮糖醛缩酶(fructose bisphosphate aldolase，Aldolase)[46]、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)[46]和磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase，PGK)[47]等。总体来说，O-GlcNAc糖基化几乎是所有糖酵解酶的直接或间接调节器。

3.3 O-GlcNAc糖基化对戊糖磷酸途径(pentose phosphate pathway，PPP)的调节

戊糖磷酸途径(PPP)是6-磷酸葡萄糖的一种代谢途径。PPP可以促进戊糖的产生并减少烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)产生，促进核苷酸与脂质的合成，有利于活性氧(oxygen species，ROS)的清除[44]。O-GlcNAc修饰在PPP通路中的调控作用近期才开始被研究。Yehezkel等[48]发现人源原发型和转移型直肠癌(colorectal cancers，CRC)细胞的O-GlcNAc糖基化修饰总体水平存在差异，OGA沉默的转移型CRC细胞整体O-GlcNAc蛋白质修饰水平增加，PPP途径的限速酶G6PD的转录水平上升，磷酸盐戊糖途径代谢通量提高将近3倍。相反，在人源乳腺癌细胞中发现随着O-GlcNAc修饰水平的下降，PPP途径中间产物如5-磷酸核酮糖、5-磷酸木酮糖和7-磷酸景天庚酮糖含量明显降低[36]。这些研究均表明O-GlcNAc修饰在戊糖磷酸途径中具有重要的动态调控作用。

除此之外，参与PPP途径的关键酶也存在O-GlcNAc糖基化修饰(图2)。Rao等[14]用化学酶标记法发现G6PD蛋白第84位丝氨酸发生了O-GlcNAc修饰。过表达OGT或者抑制OGA都能够增加O-GlcNAc修饰水平，G6PD的活性增强；而将G6PD的O-GlcNAc修饰位点突变成缬氨酸后这种现象消失[14]。此外，该研究小组通过放射性同位素标记法发现G6PD发生O-GlcNAc修饰可以增强NADPH和其他PPP代谢物的生成，提高PPP通路的活性[14]。

PPP途径中的其他酶也受到O-GlcNAc的动态调控。Miguel等[49]通过质粒转染的手段分别沉默人源肺癌细胞A549中的OGT和OGA，发现当OGT沉默时，上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的主要标志物N-钙黏蛋白减少，E-钙黏蛋白增加；而OGA沉默时，则结果相反。机制研究显示在EMT过程中，PPP途径的重要代谢酶G6PD和转酮醇酶(transketolase，TKT)表达量降低，PPP代谢途径活性代谢产物五磷酸核糖(ribose-5-phosphate，Riboes-5-P)减少，抑制核苷酸和脂质合成，减弱了对抗肿瘤进展过程中的氧化应激，使肿瘤进一步恶化。越来越多的证据表明，O-GlcNAc修饰直接或间接参与PPP途径的代谢调控，在肿瘤发展过程中对核苷酸和脂类的合成，细胞活性氧清除等生命活动中发挥着重要的作用。

3.4 O-GlcNAc糖基化对三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle，TCA)代谢物的调节

TCA循环作为糖酵解和电子传递链(electron transport chain，ETC)之间的过渡，是酶反应的重要代谢枢纽，能够产生用于生物大分子合成的重要前体代谢物[50]。O-GlcNAc修饰在TCA循环中的调控作用逐渐成为研究热点。Slawson课题组[51]通过质粒转染过表达OGT或OGA调节SILAC标记的人神经母细胞瘤细胞的O-GlcNAc糖基化水平，结果表明丙酮酸脱氢酶复合体(pyruvate dehydrogenase complex，PDH)、顺乌头酸酶(aconitase，ACO)、异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)、α-酮戊二酸脱氢酶复合体(α-ketoglutarate dehydrogenase complex，α-KGDH)和琥珀酰辅酶A连接酶(succinyl-CoA ligase，SCS)的表达量都发生了改变。随后，Ferrer等[36]采用LC-MS检测了shRNA敲除OGT的MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞中TCA代谢中间体的浓度，与Tan等[51]的实验结果一致。Ma等[52]在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠的心肌线粒体中发现TCA循环中的大部分酶存在O-GlcNAc修饰(图2)。并通过RL-2抗体(O-GlcNAc修饰抗体)进行免疫共沉淀实验，验证丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase，PDH)为O-GlcNA修饰蛋白[52]。此外，Wang等[53]在人源胰腺癌细胞中发现在延胡索酸水合酶(fumarate hydratase，FH)第75位丝氨酸残基位点发生了O-GlcNAc修饰，且该修饰有助于肿瘤细胞克服营养缺失，调节DNA修复，提高细胞存活率。这些研究均显示O-GlcNAc糖基化修饰对TCA循环中的酶存在重要调控作用。

3.5 O-GlcNAc糖基化对谷氨酰胺分解的调节

谷氨酰胺作为一种主要的能源反应物，为肿瘤细胞的生长增殖提供能量，是肿瘤能量代谢的一个重要特征[54-55]。YES相关蛋白(yes-associated protein，YAP)以及含有PDZ结合模序的转录共激活物(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif，TAZ)是肿瘤细胞中多条信号通路的信号节点，在肿瘤的谷氨酰胺代谢中起着重要的作用，可提高谷氨酰胺合成酶的转录活性，上调谷氨酰胺的水平，促进肿瘤的发生发展[56-58]。Zhang等[59]研究发现，人源肝癌细胞在高糖的情况下，YAP第241位苏氨酸发生O-GlcNAc糖基化修饰，将YAP 241位糖基化位点突变的人源肝癌细胞经尾静脉注射，在小鼠体内成瘤，突变组和未突变组相比，肿瘤增殖能力明显降低，作用机制研究表明YAP的O-GlcNAc糖基化修饰能够抑制该蛋白的磷酸化修饰，提高其转录活性，使谷氨酰胺表达量增加，从而促进肿瘤细胞增殖(图2)。Clark等[60]也检测到谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GLS)和谷氨酰胺脱氢酶(glutamine dehydrogenase，GLUD1)(图2)上存在O-GlcNAc糖基化修饰。此外，部分研究发现c-Myc[55]，HIF-1α[61]和SIRT1[62]等蛋白均通过O-GlcNAc糖基化动态调节谷氨酰胺代谢。然而关于O-GlcNAc糖基化修饰如何对这些酶的活性和功能产生调控的研究仍未清晰，因此，深入研究O-GlcNAc糖基化对肿瘤代谢中谷氨酰胺代谢的直接和间接调控机制，对以糖代谢干预为基础的新药研究与开发具有重要指导意义[63]。

图2O-GlcNAc修饰蛋白参与葡萄糖摄取、糖酵解、戊糖磷酸途径、三羧酸循环和谷氨酰胺分解过程

4 结 语

细胞代谢异常被认为是细胞发生病变的一个重要标志。近年来，越来越多的科学家开始研究肿瘤特有的代谢特征，以及在肿瘤发生发展和侵袭转移中的异常代谢。葡萄糖是生命体进行一系列活动的主要能量原料，在GLUT家族蛋白辅助下转运入细胞，通过糖酵解、HBP、PPP等途径进行代谢，产生能量供机体使用。与正常细胞不同，肿瘤细胞为满足其异常增殖的需求，即使在氧气充足的环境下，肿瘤细胞仍主要通过糖酵解途径进行葡萄糖代谢。因此，异常的糖代谢被认为是肿瘤代谢特征之一。从Pasteur提出氧气可以抑制发酵，到Warburg效应的提出，吸引越来越多的人对肿瘤异常糖代谢进行研究。随着蛋白质组学技术的发展与完善，不断有研究发现参与这些糖代谢过程中的酶存在O-GlcNAc修饰，比如GLUT1、PFK1、PKM2和G6PD等，这些酶的O-GlcNAc糖基化水平改变时，机体的糖代谢状态也会随之发生改变。由此不难推测，通过调节机体的O-GlcNAc糖基化水平可以调控机体的异常糖代谢，从而改善机体的肿瘤微环境达到抑制肿瘤细胞生长的效果。虽然对于O-GlcNAc糖基化与肿瘤糖代谢之间关系的研究不断深入，但显然目前只是冰山一角，人们只发现了部分代谢通路中的代谢酶发生O-GlcNAc糖基化修饰，对其如何影响代谢通路的具体机制尚不清楚，仍然有许多代谢酶的糖基化修饰还未被发现，但O-GlcNAc糖基化与肿瘤异常代谢之间的紧密关系是不可否认的。因此，对于糖代谢通路上关键酶的O-GlcNAc修饰的深入研究势在必行，所开展的研究必将为肿瘤的治疗及抗肿瘤药物开发提供新的思路和方向。