毛一博，陈天睿，裴 璐，李浩正

(兰州市第五十八中学，甘肃 兰州 730060)

1 引言

现代农业的发展依靠大量化肥与农药的施用，然而近年来农药的施用量有增无减，实际利用率却十分低下，且许多农药结构稳定，难以降解，这对湖泊、河流以及地下水等水体都造成了污染。农药进入生态环境造成水污染大体上可通过以下3种方式：一是未被利用的农药随雨水进入水体；二是降水、灌溉等造成的水土流失使部分尚未被利用的农药流入河流；三是农药厂或实验室将未经处理的农药直接排入河流[1,2]。

藻类具有个体小、易获得、繁殖快、对水体中的有毒物质十分敏感的特点，是农药污染的理想指示物种。藻类可用于反映水体的污染状况，一些抗逆性较好的藻类还可用于净化水体，结果更具有现实意义。在此背景下，本实验试图通过比较黑藻和金鱼藻对农药多菌灵的抗逆性以及其对于多菌灵污染水体的净化作用，初步探寻适宜大量种植的水体净化藻类，提高“保护生态资源就是造福人类”的环保意识。

2 实验部分

2.1 叶绿素的测定

2.1.1 仪器与试剂

所用仪器为UV-3200型紫外可见分光光度计(上海美谱达责任有限公司)、研钵、比色皿(2 mL)、比色管(25 mL)、水浴锅、烧杯(250 mL)、胶头滴管、分析天平；所用试剂为90%乙醇、1 mol/L HCl。

2.1.2 实验方法

使用乙醇提取叶绿素，在紫外分光光度计下分别测定未加盐酸和加盐酸的吸光度，依据公式得到含量。

2.1.3 实验步骤

用分析天平准确称量0.500 g藻类样品，放入研钵加5 mL 90%乙醇研成匀浆，全部移入25 mL比色管，用90% 乙醇定容至刻度线。置于75 ℃水浴锅中提取5 min。提取样液进行测定。采取紫外分光光度计读取其665 nm和750 nm处的吸光度数值，90%乙醇溶液为参比。之后再加入2滴1 mol/L HCl，重新测量一次。依据公式计算得到叶绿素含量[3]。

叶绿素含量=27.3(EA-Eb)

(1)

Ea为提取液酸化前波长665 nm和750 nm处吸光度之差；

Eb为提取液酸化后波长665 nm和750 nm处吸光度之差；

2.2 蛋白质的测定

2.2.1 仪器与试剂

所用仪器为UV-3200型紫外可见分光光度计(上海美谱达责任有限公司)、研钵、比色皿(2 mL)、试管、水浴锅、烧杯(250 mL)、胶头滴管、分析天平、离心机、离心管、移液管；所用试剂为pH值=7.0的磷酸缓冲溶液。

2.2.2 实验方法

提取蛋白质溶液，在紫外分光光度计中在260 nm、280 nm波长下分别测量吸光度，依据公式得到含量。蛋白质分子中色氨酸、赖氨酸的残基在280 nm下有最大吸收。核酸在260 nm处也有吸收，可以通过校正加以消除[4]。

2.2.3 实验步骤

使用分析天平精确称量0.500 g藻类样品，放入研钵中，加入pH值=7.0的磷酸缓冲溶液，研成匀浆，移入离心管2000 r/min离心10 min。用移液管取1.00 mL样液至试管当中，加入5 mL pH值=7.0的磷酸缓冲溶液，在紫外分光光度计中分别在280 nm和260 nm波长下读取吸光度，以pH值=7.0的磷酸缓冲溶液作参比[5]。依据公式计算得到蛋白质含量。

(2)

式(2)中，n为稀释倍数，本实验中n=6。

2.3 还原糖的测定

2.3.1 仪器与试剂

所用仪器为UV-3200型紫外可见分光光度计(上海美谱达责任有限公司)、研钵、比色皿(2 mL)、试管、水浴锅、烧杯(250 mL)、胶头滴管、分析天平、移液管、离心机、离心管；所用试剂为斐林试剂、蒸馏水。

2.3.2 实验方法

植物组织中的还原糖含有醛基或羰基，可以还原斐林试剂使其脱色，脱色程度与含糖量成正比，在紫外分光光度计中590nm波长下测定吸光度，对比标准曲线得到含糖量[6]。

2.3.3 实验步骤

用分析天平精确称量1.000 g藻类样品，在研钵中加蒸馏水研成匀浆，移入试管中。将试管置于80 ℃的恒温水浴中保温30 min，期间每5 min摇动一次，使还原糖充分提取出来[7]。用移液管量取6.00 mL待测液至试管中，加入4 mL斐林试剂，封口后于沸水浴中加热15 min，取出后用自来水冷却，移入离心管，1500 r/min离心15 min。取上清液，用分光光度计在590 nm波长下测定吸光度，以蒸馏水作参比。与标准曲线对照得出还原糖含量[8]。

还原糖含量=

(3)

2.4 COD(化学需氧量)的测定

2.4.1 仪器与试剂

所用仪器为COD快速测定仪(北京连华永兴科技发展有限公司)、比色皿、消解管、移液管、玻璃棒、冷却槽；所用试剂为D液(重铬酸钾溶液)、E液。

2.4.2 实验方法

在强酸性条件下通过重铬酸钾的氧化性氧化水中的诸多有机物，由机器前后比对得到COD数值，代表了水受有机物污染的程度。

2.4.3 实验步骤

使用玻璃棒搅动水体，然后立即用移液管量取水样2.5 mL在消解管中，用移液管加入D液0.7 mL，E液4.5 mL。充分振荡后，放入测量仪中充分解离，拿出后用自来水冷却，转移到比色皿中进行测量，记录数据。

2.5 色度、浊度的测定

2.5.1 仪器与试剂

所用仪器为UV-3200型紫外可见分光光度计(上海美谱达责任有限公司)、比色皿(2 mL)、胶头滴管、烧杯、玻璃棒。

2.5.2 实验方法

色度和浊度直观反映了水体清澈程度，度数越高，水体质量越差。直接量取培养藻类的水，在紫外分光光度计中320 nm波长下测得色度，580 nm波长下测得浊度。对比标准曲线得到度数。

2.5.3 实验步骤

使用玻璃棒搅动水体，以保证色度、浊度测量结果准确，然后立即用胶头滴管量取水样在比色皿中，放入紫外分光光度计中测量吸光度。对比标准曲线得出度数。

图1是浊度标准曲线，将实验中测得的吸光度带入浊度标准曲线计算出浊度，单位为度。

图1 浊度标准曲线

图2是色度标准曲线，将实验中测得的吸光度带入色度标准曲线计算出色度，单位为度。

图2 色度标准曲线

3 结果与讨论

图3、表1为两种藻类的还原糖含量对比，黑藻与金鱼藻在总趋势上都是下降的，但是在一开始，黑藻却呈现上升趋势，并在第二个周期后达到最高点，之后呈波浪式下降，且有趋于平稳的趋势。金鱼藻在一开始就有下降，能够对于多菌灵做出快速反应，之后也是呈波浪式下降，但变化幅度较大，不稳定。

因为植物中的还原糖含量与植物的新陈代谢密切相关，对此推测多菌灵会导致金鱼藻的代谢异常，从而影响其正常生长，而我们观察到金鱼藻的生长状况较黑藻明显不佳也与此推测吻合，同时两种藻类在后期都出现稳定趋势，我们推测这与植物自身的反馈调节有关。

表1 两种藻类还原糖含量变化

图4、表2为两种藻类的叶绿素含量，在一开始两种藻类的叶绿素含量都有所上升，这说明两种藻类的光合作用强度在上升，初步推测在第一个周内，藻类在水体尚能正常生长，这或许是由于叶绿体的膜结构或是细胞中存在其他结构可以延缓外界不利环境对于叶绿体的损伤；但一周之后，两种藻类的叶绿素含量都呈现大幅下降的趋势，总体图像呈现倒“V”型，这证明农药对于叶绿体的伤害较大且相关保护结构的作用存在极限。

图3 两种藻类的还原糖含量对比

表2 两种藻类叶绿素含量变化

图4 两种藻类的叶绿素含量

图5、表3为两种藻类蛋白质的含量变化图，两种藻类在这一指标上同步变化，在开始的两个周期里，藻类的蛋白质含量都呈现下降趋势，但后期金鱼藻的蛋白质含量回升更快，在实验的4个周期里金鱼藻蛋白质含量呈现上升态势，黑藻则在下降后趋于平稳。

在第四周期观察到金鱼藻出现腐烂，水中有菌落生长，结合数据我们推测，因为金鱼藻中蛋白质含量较高，既可以为水中微生物提供优良的营养，又因为蛋白质的空间结构易被破环，因此金鱼藻在农药溶液中易腐败，在不利环境中的生存能力不及黑藻。

图6、表4与图7、表5分别表示浊度与色度。从浊度比较来看，两种藻类对于水体都有着明显的净化作用，说明养殖水藻能够有效吸附水中的悬浮物，降低浊度。但从色度来看，金鱼藻后期有逐渐上升的趋势，黑藻则能够降低色度，由于金鱼藻叶片细碎，在后期水体颜色加深明显，有一组甚至发霉，导致色度攀升。

表3 两种藻类蛋白质含量变化

图5 两种藻类蛋白质含量

表4 两种藻类水体浊度变化

表5 两种藻类水体色度变化

图6 两种藻类浊度变化

图8、表6表示两种藻类COD(化学需氧量)的变化图，黑藻总体呈现下降趋势，金鱼藻则呈上升趋势，说明金鱼藻对于水体的净化能力不如黑藻，水中有机物污染加剧，在培养过程中我们也直观地看到了这种表现：在金鱼藻的4个平行样中，有一个在最后一个周期里长出了黑色霉斑，这是水体腐败到一定程度的表现。黑藻则能够降解吸收一部分水中的污染物，而且直观看来，水体中并没有金鱼藻那么多残渣。

图7 两种藻类色度变化

表6 两种藻类水体COD变化

图8 两种藻类COD的变化

4 总结与讨论

本文初步利用紫外分光光度法探究了在相同浓度的多菌灵溶液(有效成分浓度0.5 mg/L)中黑藻和金鱼藻在研究周期(4周)里的叶绿素、蛋白质、还原糖三项指标的变化，并通过比较这些生物指标来反映藻类对于农药的反应。在水体方面，通过色度、浊度、COD(化学需氧量)3个指标反映出了藻类对于水体的影响。初步得出以下结论。

(1)利用紫外分光光度法能够快速、准确地得到藻类生物指标的具体数值，这一方法可以广泛的应用于各种植物的各项生物指标的准确检测。

(2)黑藻对于多菌灵溶液的抗逆性更好，在本实验的3个指标中，黑藻表现更好，指标更加稳定，部分指标在最后还有上升的趋势。金鱼藻则呈现出下降趋势，并且可以明显观察到叶片的腐烂、变黄，这说明金鱼藻更易腐烂。

(3)黑藻对于水体净化效果更好，在浊度和色度两个指标上黑藻更低一些，而金鱼藻则导致水体浑浊。在COD指标上，黑藻有明显的优势，这说明水体中的有机农药能够被黑藻吸收。

(4)同时，实验表明在池塘、鱼缸等地方养殖金鱼藻并不是一个十分明智的选择，适当种植黑藻或许更加有利于水体净化，可以延长抽换水的周期。

综上所述，多菌灵作为广谱杀菌剂对于黑藻和金鱼藻确实有影响，金鱼藻由于其较高蛋白质含量，对于农药更加敏感，各项指标变化更加明显、波动更大，致使水体明显浑浊；黑藻则对多菌灵表现出良好的抗逆性，其生理指标较稳定，且对于水体的净化效果明显。

本实验运用化学方法来分析生物生长状况，结论更为客观、直观，实验过程快捷，且适用面广泛。但由于实验时间、个人能力的不足对多菌灵对于黑藻和金鱼藻的影响探究不足，讨论后认为应当在以后进行后续实验围绕以下几点探究。

(1)设置浓度梯度来研究各种浓度的农药对于两种水藻的影响，寻找水藻降解农药的最有效率浓度。

(2)增加藻类种类，寻找一种最为经济、高效的降解多菌灵的藻类，这样可以使得这个实验的实际应用更加可能。

(3)为落实多菌灵对于藻类影响是直接影响还是通过影响水体间接影响藻类设计进一步实验。