郭薇霞,唐 健,何建萍,罗胜军,黄 铠,林克勤,褚嘉祐,杨昭庆△

(1.中国医学科学院&北京协和医学院医学生物学研究所遗传室,云南昆明 650118;2.昆明市妇幼保健院遗传室，云南昆明 650031)

异常血红蛋白是由于珠蛋白基因突变导致珠蛋白分子结构和功能异常的一类血红蛋白，当产生临床表现时称为异常血红蛋白病[1]。异常血红蛋白的种类和分布频率存在地域和人种差异[2]，根据人类血红蛋白变异体数据库HbVar(http://globin.bx.psu.edu/hbvar/menu.html)结果显示，目前全世界报道的发生在α珠蛋白肽链上的异常血红蛋白超过490种，我国报道的有38种。大多数异常血红蛋白是由于珠蛋白链上单个碱基替换引起的，不产生临床症状，因此需要借助血红蛋白电泳和基因检测才能确诊[3]。本研究通过对血红蛋白电泳结果异常的1例样本进行了基因诊断，检出了1例α珠蛋白基因新突变型，现报道如下。

1 资料与方法

1.1研究对象 先证者：女，26岁,就诊于云南省昆明市妇幼保健院。由于无法联系到这患者及其家属，未采集到家系其他成员血样。

1.2方法

1.2.1血液学检查 取静脉血2 mL，乙二胺四乙酸钾(EDTA-K2)抗凝后，采用血细胞分析仪日本sysmex XT-2000i检测红细胞数量、血红蛋白含量(Hb)、平均红细胞体积(MCV)和平均血红蛋白含量(MCH)等血常规指标。采用欧洲helena V8全自动毛细管电泳仪进行血红蛋白电泳检测。

1.2.2常见地贫突变基因检测 采用PCR-反向点杂交法检测23种中国人常见的地中海贫血基因型(SEA、-α3.7、-α4.2、αCSα、αQSα、αWSα、41-42M、654M、-28M、71-72M、17M、βEM、IVS-I-1M、IVS-I-5M、27/28M、43M、-29M、-30M、31M、-32M、14-15M、IntM和CAPM)。所用试剂为亚能生物技术(深圳)有限公司提供的地中海贫血基因检测试剂盒。

1.2.3α和β珠蛋白基因片段扩增 采用Axygen公司的AxyPrep血基因组DNA小量制备试剂盒，严格按照说明书操作提取全血DNA。根据NCBI中α、β珠蛋白基因序列设计引物扩增包括转录启动子序列及3个外显子在内α、β珠蛋白基因序列。引物序列如表1所示，由昆明硕擎生物技术有限公司合成。PCR扩增采用大连宝生物公司的TaKaRa LA Taq酶，仪器使用美国ABI公司的9700 PCR扩增仪。β基因、α1基因、α2基因PCR扩增体系均为30 μL:每一反应体系含2×GC Mix Buffer 15 μL、上下游引物各0.3 μL、LA Taq 0.2 μL、H2O 11.2 μL、DNA模板含量约100 ng。反应条件为：94 ℃ 4 min，94 ℃ 45 s，64 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，共35个循环，72 ℃延伸20 min。

1.2.4α和β珠蛋白基因片段测序 纯化PCR产物后，送昆明硕擎生物技术有限公司进行测序，见表1。

表1 α、β珠蛋白基因扩增引物

续表1 α、β珠蛋白基因扩增引物

2 结 果

2.1血常规结果 先证者血常规结果为：RBC 4.61×1012、Hb 143 g/L、MCV 92.4 fL、MCH 31 pg，为正细胞正色素，无明显异常。

2.2血红蛋白毛细管电泳结果 先证者HbA占总血红蛋白含量为76.35%、血红蛋白A2(HbA2)为1.42%、血红蛋白(HbF)含量异常升高，达到了18.56%，产生一个未命名的未知条带，含量为3.10%，如图1所示。

2.3基因型检测结果 先证者检出HbA2基因第27位密码子GAG>CAG，Glu>Gln杂合突变，采用人类基因组变异协会(HGVS)命名规则命名为HBA2:c.82G>C(图2)，未检出α、β地贫基因突变。

注：产生与HbF未完全分离的未知异常条带

图1HbMile血红蛋白电泳图

注：α珠蛋白基因第27位密码子GAG>CAG杂合突变，箭头表示突变

图2HbMile测序图

3 讨 论

我国异常血红蛋白的发生率和分布存在明显遗传多态性，2003年全国各地区异常血红蛋白发生率普查结果显示云南异常血红蛋白发生率最高，达到了5.93%[4]。目前云南报道较多、最常见的异常血红蛋白为HbE[5]，也有一些罕见异常血红蛋白如Hb Rush的报道[6]。而本研究此次检出的Hb Mile为世界范围内首次报道。

该突变携带者是26岁女性在进行地中海贫血产前筛查时，常见地贫基因检测结果都为阴性，但是血红蛋白电泳检查结果却较为罕见与复杂。经过复查后发现该突变产生的未知异常血红蛋白条带与F带利用等点聚焦毛细管电泳技术不能完全分开，在电泳结果图上表现为F带与异常条带波谷融合，此时检测到的F带含量为18.56%，是HbF和部分异常条带含量的总和。为了进一步明确异常血红蛋白条带产生的原因所以进行了血红蛋白基因测序检查，最终检出α珠蛋白基因HBA2第27位密码子GAG>CAG杂合突变。

本研究检出的Hb Mile是由于α2珠蛋白基因第27位密码子GAG>CAG杂合突变(HGVS命名HBA2:c.82G>C),导致该位置上的谷氨酸(Glu)被替换为谷氨酰胺(Gln)，该突变先前未见相关报道，这是首次报道，并以先证者的籍贯地云南弥勒命名。蛋白质三维结构分析显示该突变位于α珠蛋白的保守区域，与β珠蛋白交联的位点[7]。尽管该G>C突变从未报道过，但是该位置上报道过其他突变类型Hb Shuangfeng (HBA2 or HBA1:c.82G>A)，这一突变在一中国汉族家系中发现，它是第27位密码子谷氨酸被赖氨酸替代，产生含量为13%的不稳定异常血红蛋白，杂合子个体即产生了溶血性贫血的临床症状[8]。提示这一位点在维持血红蛋白稳定性方面发挥重要作用，但是本研究中Hb Mile先证者血液学参数正常，推测可能是由于替换的氨基酸Gln与原来的Glu性质相似，所以突变后对血红蛋白的功能影响较小，携带者不产生临床表现。

由于大多数异常血红蛋白不产生临床表现，所以只通过血常规指标难以有效筛查血红蛋白病，而毛细管电泳具有更高的分辨率和准确性，目前已经成为实验室诊断血红蛋白病的重要手段之一[9]。但是由于异常血红蛋白具有异质性，同一电泳区带可能是由多种突变造成[10]，而本研究中则出现了利用毛细管电泳技术也不能将异常条带与F带完全分离的罕见状况。若能重新采集患者及家系成员血样，可以考虑使用分辨率较高的高效液相色谱法对异常血红蛋白含量进行检测。因此将血红蛋白电泳和基因诊断相结合，才有利于检出更多的异常血红蛋白突变型，基因检测结果能指导电泳结果进行正确解读。

4 结 论

本研究首次报道了α珠蛋白基因突变型Hb Mile(HBA2:c.82G>C，CD27:Glu>Gln)，丰富了我国和人类血红蛋白突变谱。通过对表型进行初步分析，该突变不产生明显临床症状，但是由于云南是地中海贫血和异常血红蛋白病高发区，异常血红蛋白突变有较大概率产生复合杂合子，因此其临床危害性和人群发生率有待于继续研究。