周笑伶,曹 勤 综述,王生余△ 审校

(1.江苏省第二中医院检验科，江苏南京 210017；2.南京中医药大学第二附属医院检验科，江苏南京 210017)

宫颈癌发病率位居全球女性恶性肿瘤第二位，每年因宫颈癌死亡人数达27万人，占女性肿瘤病死率的首位(其中80%发生在发展中国家)，并以每年50万新增病例的速度增长[1]。研究发现，99.7%的宫颈癌患者存在人乳头瘤病毒(HPV)感染[2]，且HPV的持续感染是导致宫颈癌前病变和浸润癌的必要因素[3]。

HPV是一种长度为50～55 nm，无包膜的小分子双链DNA病毒，HPV仅编码八个基因，包含支持病毒DNA复制的6个早期基因(E1、E2、E4、E5、E6、E7)和编码病毒组装与释放所必需衣壳蛋白的2个晚期基因(L1、L2)。病毒编码的癌基因不会导致宿主细胞的直接转化，但会诱导免疫逃逸和异常细胞增殖使基因组结构畸变和突变[4]。按照潜在致癌性，通常将HPV病毒分为低危型和高危型，高危型HPV的持续感染可引起宫颈上皮内瘤变(CIN)和宫颈癌[5]。事实上，90%的宫颈癌可以通过早期检查得以治愈，美国因及时筛查出早期癌前病变并治疗，使得宫颈癌发病率和病死率下降了60%[6]，而发展中国家缺乏定期的健康检查和正规的医疗保健体系，往往错过了宫颈癌的早期诊断，病死率是美国的50倍[5]。因此，亟待推行一个快速、低成本的人口水平筛查和监测的方法，来降低宫颈癌的发病率，提高人民健康水平。

巴氏染色宫颈细胞学涂片检查是已知最早的宫颈癌筛查标准，自20世纪50年代引入临床，使55岁以下宫颈癌病死率下降60%[7]。到了90年代，薄层液基细胞学检查(TCT)取代了巴氏涂片检查，使高分化鳞癌检测灵敏度提高1.29倍，但对于细胞学结果的解释不仅与相关人员的经验和水平相关，而且对于血液模糊、炎症干扰、固定不良、细胞溶解或细胞不足(<5 000个可见的液基细胞)的样本，或是有争议的细胞涂片，如非典型的意义不明确的非典型鳞状细胞、不能排除高度鳞状上皮内病变的非典型鳞状细胞和非典型腺体细胞，则需要进行分子学检测以得到更明确的诊断[8]。HPV检测被FDA(美国食品药品监督管理局)批准用于对宫颈细胞学检查结果异常的患者进行后续检测，以避免不必要的阴道镜检查。

1 人乳头瘤病毒主要检测方法

1.1第二代杂交捕获法(HC2)检测HPV-DNA HC2检测法由Digene公司开发，并于1999年被FDA批准，其实质是分子杂交信号放大技术。该检测方法采用能检测出13种高危型HPV的多基因RNA探针，捕获结合后的杂合体至包被有单克隆抗体的板孔上，最后借助信号放大和化学发光技术完成基因水平检测。

临床研究表明，HC2检测法可指示高危型HPV-DNA的存在，且对高度组织病变具有高灵敏度，比宫颈细胞学检查更易发现高度病变人群[9]。但是，该方法无法区分特定的HPV基因型，不包含内部对照，且探针使用时，存在碱基对错配、探针混合物与非靶向的高危和低危的HPV6、11、26、30、40、42、53、54、61、67、70、73、81、83、84、87和91交叉反应等问题[10]。

1.2酶切信号扩大法(Cervista HPV-HR)检测HPV-DNA Cervista HPV-HR检测法由Third Wave Technologies公司开发，并于2009年被FDA批准。基于专利Invader信号放大化学发光技术，该方法在等温反应环境下，借助Cleavase酶特异识别、切割目标DNA分子结构，并利用能检测出L1，E6和E7基因序列的特异探针完成对14种高危型HPV-DNA的识别、检测。与HC2检测相比，该方法具有样本量少，包含内、外部对照，交叉反应较低等优点，但仍不能进行单个基因分型[10]。

1.3实时荧光定量PCR技术(Cobas 4800)检测HPV-DNA Cobas 4800 HPV检测法由Roche Molecular Diagnostics公司开发，并于2011年被FDA批准。该检测采用多重实时PCR和与4种荧光报告探针进行的核酸杂交技术，完成对14种高危型HPV的L1基因的核苷酸序列的同时检测。实验使用β-珠蛋白作为提取和扩增的内部对照，外部设有阴、阳性对照来保证运行质量。该系统由两个独立的仪器组成，包括用于自动化核酸提取的Cobas z480仪器和用于在单个管中进行PCR扩增和检测反应的Cobas x480分析仪。可以检测14种高危型HPV并对HPV16和HPV18进行单独的基因分型。与HC2法相比，Cobas 4800试验具有与HC2相当的临床敏感性，并且由于与低风险HPV基因型的交叉反应水平较低[11]，特异度提高。但也可能出现假阴性结果，因为L1基因在大量癌症中整合到人类基因组中时会丢失，在这种情况下，仅检测L1基因的HPV测试系统就可能出现假阴性结果[12]。

1.4逆转录扩增法(Aptima HPV)检测E6/E7 mRNA Aptima HPV检测法由Hologic Gen-Probe公司开发，并于2012年被FDA批准。该方法通过检测高危型HPV E6/E7癌基因mRNA间接测定HPV-DNA含量。研究表明，病毒癌基因E6和E7能促进被感染细胞中的肿瘤抑制基因p53降解，并改变调节细胞周期的蛋白质的活性，导致细胞转化。此外，尽管E6和E7基因表达量少，但其过表达可能与疾病进展直接相关。Aptima HPV检测法可检测14种高危HPV类型的E6/E7 mRNA转录物，而且不与低危型HPV(HPV6、11、42、43、44、53、61、71和81)产生交叉反应，具有相当高的分析灵敏度，但仍不区分HPV类型[13]。

此外，上述方法需要高度专业化和体积庞大的仪器用于样品预处理和后续检测，例如Cobas HPV系统重量超过150 kg，宽度为166 cm，而Cervista HPV HR检测系统重量约363 kg，高度超过175 cm，并且PCR扩增过程中对实验设备要求也特别严格，通常要求检测设备必须符合标准PCR荧光实验室的设置要求并通过国家临床检验中心的验收和认证，同时检测人员须通过临检中心培训并取得合格证书，操作环境保证无菌无尘。这些对于基础设施比较差的发展中国家，尤其是一些偏远的基层医院是难以实现的，因此，能够分离和检测核酸生物标志物的简单且有效的整合平台仍然是医学诊断中的重要需求。

1.5核酸筛选的最新发展——微流控芯片技术 近年来，随着PCR扩增技术及微流控技术的发展，学者们开发了一个能集成样品装载、细胞溶解、扩增及检测于一体的微流控芯片，并将该芯片成功地应用于HPV-DNA的检测[14]。与上述几种传统的方法相比，该芯片具有灵活，体积小巧，便于移动，可自动操作等特点，可为不同的样本提供标准化预处理单元，从而消除了因离心、混合和冻融步骤所导致的场地问题，甚至是PCR扩增的标准化问题。此外，该芯片还可以避免样品多步处理过程中出现内源性核糖核酸酶激活、不适pH值和温度，从而导致的样品降解[15]。大量研究表明，这种能快速分离出病毒DNA，并在最小化人为干预的情况下，将其传送到检测装置传感器的封闭集成单元内的微流控系统是目前HPV检测的最佳选择。

一般来说，用于制作微流控芯片的材料主要包括：晶体硅、玻璃、石英、塑料和高分子聚合物等。其中，高分子聚合物(如聚甲基丙酸甲酯PMMA，聚苯乙烯PS等)由于具有加工方便、成本低、易批量生产等优点，被广泛用于微流控芯片制造。微流控芯片制作的方法包括机械加工法、刻蚀法和模具法。其中，模具法由于具有低成本、快速成型、良好的光学性能和绝热绝缘性能、易于封装等特点，被广泛使用于微流控芯片加工[16]。图1A为Rheonix公司制作的用于HPV DNA检测的微流控芯片，每个芯片由4个微流控通道阵列而成，可同时对4个样本进行全自动化检测。该芯片由1.0 mm厚的含有不连续通道的聚苯乙烯层和38 μm柔性聚苯乙烯层通过弱溶剂层压法压制而成。不连续通道间包含一组隔膜袋，并与安装在其上的聚苯乙烯层结合，构成图1B所示的泵/阀装置。实验中，对隔膜袋中的孔施加正压，聚苯乙烯柔性层被向上推动，不连续通道断开，完成阀门关闭，流体流动阻断；对隔膜袋中的孔施加负压，聚苯乙烯柔性层被拉入隔膜袋中，不连续通道连通，完成阀门开启，流体在毛细作用下流动。依此规律，串联的多个隔膜袋中的孔内压力可依据设计的控制程序完成规律性变化，最终实现流体单/双向流动控制，这为液体混合提供附加的通用性和有效性[17]。

A:微流控阵列;B:泵/阀装置

图1RheonixQuadCARD芯片外形

目前，基于微流控平台，发展了许多用于生物分析的相关技术，如细胞分析[18]，核酸分析[19]，蛋白质工程[20]，突变检测[21]，床旁检测[22]等。KASAMA等[23]开发了基于聚苯乙烯微珠的微流体免疫吸附测定系统，用于分析人类免疫球蛋白A，使样品体积缩小至微升范围，抗原-抗体反应时间从15 h缩短至10 min。ZHANG等[24]集成了微流控和微珠阵列技术，开发了检测血清提取物中HBV基因型的敏感片上病毒DNA分析方法。作者指出若使用TAMRA作为标记，试管法只能在0.1 nmol/L的靶DNA浓度下产生明显的荧光信号，而芯片病毒基因分型可区分0.03 nmol/L的靶DNA；若使用量子点作为标记，芯片法甚至可检测到4pM的靶DNA。与传统的平面DNA芯片(通常>1 h)相比，微流控芯片提供了更高的分析灵敏度和更短的反应时间(<30 min)。

2 微流控芯片技术方法

微流控芯片法基本过程包括核酸提取、PCR扩增和反向斑点杂交。

2.1核酸提取 将待测样本加入芯片加样孔，在微泵驱动下，利用磁珠分离技术，即在通道内磁性、界面和黏性阻力的作用下，样本与靶物质结合，从而快速高效地提取细胞DNA，同时很好地避免了人工提取过程中产生的污染和误差。ZHANG等[25]开发了一种3D打印微流控芯片，并用实时q-PCR结果证明，其可以利用磁性运动，通过水油界面屏障来过滤样本污染物并提纯目的核酸，称该芯片能在15 min内高效提取HPV18质粒，且提取效率达到61%(HPV质粒浓度为5×10至5×106copy/100 μL)，可以在大范围HPV质粒浓度下实现较高萃取率。该过程保证了高纯度的目的DNA检测的准确度，是微流控芯片技术向着自动化和微型化发展的前提保障[26]。

2.2PCR扩增 针对HPV基因组设计特异度引物，对目的DNA进行PCR扩增，扩增出24种HPV基因型的目的片段，即可同时检测出18种高危型HPV(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82、83)和6种低危型HPV(HPV6、11、42、43、44、81)。

2.3反向斑点杂交(RDB) 将针对HPV基因组设计的24种亚型的探针包被在芯片检测区杂交膜上，若扩增产物中含有目的基因，则可被芯片上的探针捕获，经酶和显色液作用后可判断出感染人乳头瘤病毒核酸及感染的亚型。不同于传统固定靶DNA一次只能检测一种核酸型的杂交方式，包被探针再与目的DNA杂交的反向斑点杂交技术实现了同时检测多种基因型的需要，使得检测更加快速高效。与HC2相比，虽然两种方法在HPV阳性检出率上趋于一致，但RDB在反映检测方法准确性的Yondon指数时更敏感[27]，而且检测成本更加低廉。

3 微流控芯片技术在HPV-DNA检测中的应用

微流控芯片系统实现了自动取样、核酸纯化、扩增和检测于一体，且具有灵敏度高、检测速度快、易于微型化、成本低廉等优点，已被开发用于HPV-DNA的检测并得到了很好的结果。TASOGLU等[1]设计的微流控芯片，与传统的核酸序列扩增相比，扩增至相同的荧光水平下，芯片法只需要1/2 000的样本量。YUE等[18]构建了一种基于微流控和微珠阵列集成的多路复用生物分析敏感平台，并采用该平台平行检测和区分了4种HPV基因型，同时鉴定了6种蛋白质标记物。研究结果表明该芯片可以检测出25 pmol/L带有特异度序列的目的DNA，在芯片外检测中，需要靶DNA浓度达到360 pmol/L以至于信噪比(SNR)>3。此外，该平台与传统的流式细胞术相比，具有试剂消耗少、样品注射简单、标本污染少和灵敏度高等优点。ZHANG等[28]开发了一种基于微流体装置和微珠阵列的检测HPV基因型的方法。研究结果表明，该方法能分辨低至1 fmol/L (10 zmol/chip,SNR>3) 的HPV寡核苷酸DNA，且信号放大后使得芯片检测灵敏度是芯片外的1 000倍。作者还指出该方法还可以对10 copy/μL 的HPV基因组DNA的PCR产物进行分辨和基因分型，检测范围从1 copy/μL至1×105copy/μL。

微流控系统的出现还为HPV细胞的收集和即时检测提供了条件，BONK等[29]研究出了适用于微流控癌症筛选装置的模型，通过将与HPV感染相关的跨膜蛋白α6整合素的抗蛋白抗体涂覆于微通道表面，在微通道16～20 μL/min流速范围内，正常细胞被洗脱而HPV感染细胞被保留，可收集这些病理细胞用于后续检测。HWANG[30]在研究中指出，使用基于微流控技术发展起来的即时检测(POCT)技术，检测HPV16-DNA在样本中的表达，结果与常规RQ-PCR方法一致(Kappa=1)，因为省略了分离和显色步骤，使临床样本实现即时检测成为可能。

4 小 结

微流控芯片技术在HPV检测中主要有两种用途：(1)用于宫颈细胞学检查结果异常的患者。如存在非典型的意义不明确的非典型鳞状细胞、不能排除高度鳞状上皮内病变的非典型鳞状细胞和非典型腺体细胞的患者筛查，需要进行分子学检测以得到更明确的诊断，以确定是否需要进行阴道镜检查。(2)对易感女性进行病毒检测及风险评估，为临床医生制定合理的治疗方案提供依据。

微流控芯片技术的发展，为癌症筛查、早期诊断、自我保健、疫苗接种和手术后监测提供了依据。因其在基因诊断方面的巨大潜力，此项技术也一定会更多应用到其他疾病相关分子水平的检测中，如传染病、肿瘤、对过敏原的免疫应答、免疫疗法和化疗等，成为更多疾病探寻致病机理和核酸分析的手段。