李佳明，裴红运，赵文婧，高玉花，张向阳*

1.济宁医学院临床医学院，272067；2.济宁医学院基础医学院，272067

茶叶是我国的国饮，含有咖啡碱、多酚类化合物、维生素类、氨基酸类等，因具有降血脂、减肥、预防心血管疾病、抗辐射、抗氧化、延缓衰老、助消化等作用，而被誉为健康的自然护卫者[1]。古小玲[2]、邱贺媛等[3]曾开展过茶叶中亚硝酸盐检测研究，但目前我国尚未制订茶叶中亚硝酸盐含量的限量标准，国内外学者对于茶叶中亚硝酸盐含量的测定研究鲜有报道，因此笔者对不同种类发酵茶中亚硝酸盐含量进行了测定，并建立了一套快速的测定方法，以供行业相关人员参考。

一、材料与方法

1.试剂与仪器

（1）实验材料

市场购买的半发酵茶（铁观音、大红袍），全发酵茶（正山小种、金骏眉），后发酵茶（湖南安化黑茶、云南普洱茶）。

（2）实验仪器

754型紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）、电子天平FA2104N（上海精密科学仪器有限公司）、高速粉碎机、硅胶干燥器、KQ5200DV 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、双列八孔电热恒温水浴锅、UPD-IV-10T（纯水型）优普系列超纯水器（四川优普超纯科技有限公司）、常用实验玻璃仪器。

（3）实验试剂

所用试剂均为分析纯（亚铁氰化钾、乙酸锌、硼酸钠、对氨基苯磺酸、二盐酸-1-萘乙二胺、亚硝酸钠、浓盐酸、冰醋酸、浓硫酸、碱式乙酸铅），所用水为超纯水（自制）。

2.超声萃取-重氮偶合光度法

（1）样品预处理

取上述市购的6 种茶叶烘干至恒重，分别用高速粉碎机粉碎混匀后装于密封袋中备用，依次编号为样品1～6。

（2）样品中亚硝酸盐的提取

分别准确称取3.0 g（精度为0.0001 g）经高速粉碎机粉碎混匀的茶叶样品，分置于6 个250 mL 锥形瓶中，再分别加入70℃热水[2]约150 mL，量取5 mL饱和硼酸钠溶液（后发酵茶量取7.5 mL）加入锥形瓶中，搅拌混匀。将上述6个锥形瓶放入数控超声波清洗器中超声萃取10 min[4]（40 kHz，40 W）。

（3）超声萃取液的净化

在6 种萃取液中分别加入2.5 mL 亚铁氰化钾溶液（后发酵茶量取3.75 mL），摇匀；再分别加入2.5 mL 乙酸锌溶液（后发酵茶量取3.75 mL），摇匀。冷却至室温的6 种萃取液分别转移到6 个250 mL 容量瓶中，加水至刻度，摇匀，放置30 min。分别用滤纸干过滤，弃去初滤液15 mL，滤液备用。

（4）滤液的脱色

取50 mL 经净化处理后的滤液于100 mL 容量瓶中，加1 mL 饱和碱式乙酸铅溶液，加水定容，摇匀，过滤，弃去初滤液数滴，在上述滤液中取50 mL 于100 mL 容量瓶中，加0.05 mL 硫酸溶液（4.5 mol/L），加水定容，摇匀，过滤，弃去初滤液数滴，滤液为提取液备用。

（5）亚硝酸盐含量的测定

标准曲线的绘制：准确吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL亚硝酸钠标准液（1 μg/mL），分别置于6 支具塞比色管中，并编号为标1～标6。在每支比色管中分别加入0.4 mL 对氨基苯磺酸溶液（4 g/L），混匀，静置5 min，然后加入0.2 mL二盐酸-1-萘乙二胺溶液（2 g/L），定容至10 mL，摇匀，静置15 min，用分光光度计于540 nm 处测定各溶液的吸光度[5]。以亚硝酸盐浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

不同发酵茶提取液中亚硝酸盐含量测定：准确吸取上述6 种脱色液8.0 mL 于6 支具塞比色管中，分别标记为样1～样6。于6 支具塞比色管中分别加入0.4 mL 对氨基苯磺酸溶液（4 g/L），混匀，静置5 min；然后分别加入0.2 mL 二盐酸-1-萘乙二胺溶液（2 g/L），6支具塞比色管均加水定容至10 mL，混匀，静置15 min。用1 cm 比色皿，以“标1”为调零管，将样品管1～6 于540 nm波长处测定吸光度，读取数据记录。

根据标准曲线得出样品管中亚硝酸盐的浓度，并按下式计算样品中亚硝酸盐的含量。

式中： X 为样品中亚硝酸盐的含量（mg/kg）；A1为样液中亚硝酸盐的质量（μg）；m为样品的质量（g）；V1为测定用样液体积（mL）；V0为样品处理液总体积（mL）。

3.水浴提取-重氮偶合光度法

在上述实验开始的同时，按照国标方法——水浴提取-重氮偶合光度法，测定不同发酵茶中亚硝酸盐含量[6]。

二、结果与分析

1.亚硝酸盐标准曲线的绘制

测得标准亚硝酸盐溶液各管的吸光度依次为0、0.022、0.042、0.062、0.082、0.099，以亚硝酸盐浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线（图1）。

图1 亚硝酸盐标准曲线

绘制的标准曲线，在0～0.1 μg/mL 范围内亚硝酸盐质量浓度与吸光度呈良好的线性关系，线性回归方程为Y=0.99286X+0.00152（Y 为吸光度，X为亚硝酸盐浓度），相关系数为0.99877。

2.超声萃取-重氮偶合光度法准确度实验

采用超声萃取-重氮偶合光度法对已知质量浓度为0.10 μg/mL 的亚硝酸钠标准液进行20 次测定，其平均值为0.0971 μg/mL，偏倚为-0.0029 μg/mL，说明本方法具有良好的准确度，测定结果见表1。

同时，随机选取同一样品6，分别采用超声萃取-重氮偶合光度法进行20 次亚硝酸盐的提取检测，测定结果见表2。经计算，相对标准偏差为4.1320%，说明该方法具有良好的重现性。

3.样品亚硝酸盐含量的测定

采用超声萃取-重氮偶合光度法和水浴提取-重氮偶合光度法进行测定，根据标准曲线得出样品中亚硝酸盐的浓度，并根据前文公式计算出不同茶叶样品中亚硝酸盐的含量。提取检测过程重复20 次，取平均值。两种方法的测定结果（表3），无差异性。

三、讨论

采用超声萃取-重氮偶合光度法对已知质量浓度为0.10 μg/mL 的亚硝酸钠标准液进行20 次测定的偏倚为-0.0029 μg/mL，说明该方法具有良好的准确度。同时采用该方法对云南普洱茶样本进行20 次亚硝酸盐提取检测的相对标准偏差为4.1320%，说明该方法具有良好的重现性。通过超声萃取-重氮偶合光度法20 次提取测定的铁观音、大红袍、金骏眉、正山小种、安化黑茶、云南普洱茶样品中的亚硝酸盐含量平均值分别为0.17、0.50、1.17、1.50、3.87、4.53 mg/kg，水浴提取-重氮偶合光度法20次提取测定的亚硝酸盐含量平均值分别为0.17、0.47、1.17、1.53、3.90、4.53 mg/kg。对比两种方法所得数据，并无差异性。说明超声萃取-重氮偶合光度法与常规国标方法——水浴提取-重氮偶合光度法的测定结果无差别，但超声萃取-重氮偶合光度法测定发酵茶中亚硝酸盐含量简便省时，速度快，且不需要加热，适应于批量测定[7]。该方法在蔬菜[4-5]、酱腌菜[8]等食品的亚硝酸盐检测中有过使用报道，且都达到了良好的检测效果，但用于发酵茶中亚硝酸盐的检测未见报道，因此，超声萃取-重氮偶合光度法测定茶叶样品中的亚硝酸盐含量可行。

表1 亚硝酸盐标准液准确度测定结果

表2 准确度测定结果

表3 样品亚硝酸盐浓度和含量比较

本实验采用亚铁氰化钾与乙酸锌反应生成的氰亚铁酸锌吸附茶中蛋白质共沉淀，再经定容、静置、干过滤去除蛋白质。

采取重氮偶合反应法测定提取液中亚硝酸盐含量，其原理是在弱酸条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，生成的重氮盐再与二盐酸-1-萘乙二胺偶合生成紫红色偶氮化合物[2,9]。

亚硝酸盐传统的提取和检测方法大多用于蔬菜、肉制品、腌菜等样本的检测，其提取液的颜色较清澈，检测过程中并没有考虑色素的干扰问题，即使脱色，大多是使用活性炭[4,10]。由于茶叶中含有多酚类化合物和茶色素等特殊的成分[2]，所以不同提取液的颜色也深浅不一，这些色素的存在对吸光度有较大影响而干扰检测结果。因此，用比色法测定茶叶中的亚硝酸盐含量时，去除样品滤液中色素的干扰十分重要。依据高海荣等[11]的报道，经过反复试验，发现在超声萃取并净化后的滤液中加入碱式乙酸铅可以达到良好的脱色效果，优于活性炭，并摸索出碱式乙酸铅的加入量。净化后的滤液经碱式乙酸铅脱色后，再采用重氮偶合光度法测定提取液中的亚硝酸盐含量，提高了亚硝酸盐测定的准确度。该脱色处理方法原理在于碱式乙酸铅在水溶液中能与黄酮类化合物等水溶性色素生成难溶的铅盐或络盐沉淀，并通过在滤液中加入硫酸溶液除去过量碱式乙酸铅，同时保证溶液在酸性的条件下完成重氮偶合显色[2]。

本实验探索并建立了超声萃取-重氮偶合光度法快速检测茶叶中亚硝酸盐含量的检测方法，可为厂家改进生产方法和行业人员快速检测提供参考。