张群 刘超 李蕾

【摘 要】 目的：采用实时荧光定量PCR仪检测流感样病例标本中的流感病毒，分析其检测效果。方法：在2018年1月至2018年12月实验室所收集的120例流感样病例患者作为本次研究对象，分别采取流感病毒细胞分离检测法和实时荧光定量PCR检测法，分析其检测结果。结果：实时荧光定量PCR法检测阳性率明显高于流感病毒细胞分离检测法，P<0.05具有统计学意义。结论：对流感病毒进行检测时可以优先考虑选择实时荧光定量PCR法，其检出阳性率更高，值得进行推广应用。

【关键词】 实时荧光定量PCR仪;细胞培养;流感病毒检测

【中图分类号】R715【文献标志码】B【文章编号】1005-0019（2019）09-197-01

流感病毒也可以称为流行性感染，其症状和普通感冒没有明显差别，很容易混淆。实验室中对流感病毒进行检测的传统方法用时比较长，而且其技术要求比较高，无法及时诊断出暴发疫情。而实时荧光定量PCR技术主要是通过PCR针对核酸进行扩增[1]，其探针技术具有较高的特异性，采取定时定量检测的方法，相比于常规性的PCR检测，其特异性更强、灵敏度更高，具有更高的应用价值。本文针对实验室流感病毒样本采取实时荧光定量PCR技术进行检测，具体内容如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

在2018年1月至2018年12月实验室所收集的120例流感样病例患者作为本次研究对象，患者均对研究知情并同意提供样本参与本次研究，样本为所有研究对象的咽拭子标本，研究对象复核流感样病例的定义，身体温度都在38℃以上，存在咳嗽、咽痛等临床症状。采集得到的标本将其存放在3ml的病毒采样管中，在24小时内送到实验室进行检测，样本留置时间不能过长。

1.2 方法

细胞分离检测法具体操作：对标本应用细胞培养法进行分离、接种，再根据类型分类，每瓶25ml的比例对每份标本进行接种，每份标本接种2瓶，从第2天观察标本是否存在细胞病变，当75%-100%細胞出现病变时进行收获，即使无细胞病变也应该于第7天收获。再用豚鼠血展开血凝试验，观察血凝度及其滴度，当血凝滴度取得数值小于1：8或者是阴性培养物在传到第2代依然为阴性则可以将这些标本抛弃。结合国家流感中心标准参照血清，实施HAI试验，将流感病毒进行分型。

实时荧光定量PCR仪检测具体操作：所有样本都需要进行病毒检测，按照试剂盒说明提取RNA及配置反应体系，实时荧光PCR系统操作时应用SDS软件，设置有阳性以及阴性的对照，其反应流程包括以下：30min设定为50℃、3min设定为95℃、15s设定为95℃、30min设定为50℃、1min设定为72℃这五个循环;10s设定95℃、40s设定55℃为40个循环。其中将FAM设定为荧光素，当在55℃时进行荧光信号的收集。

2 结果

这些样本中经病理诊断：新甲型H1N1流感病毒72份，季节性H3亚型病毒23份，乙型病毒15份。细胞分离检测法：检测出新甲型H1N1病毒65份，占比54.2%，季节性H3亚型病毒20份，占比16.7%，乙型病毒有15份，占比12.5%，未能明确的流感病毒15份，占比12.5%。阳性检出率为87.5%。实时荧光定量PCR法检测：检测出新甲型H1N1流感病毒74份，占比61.7%，季节性H3亚型流感病毒22份，占比18.3%，乙型流感病毒20份，占比16.7%，未能明确的病毒4份，占比3.3%。检出阳性率为96.7%。实时荧光定量PCR检出阳性率高于细胞分离检测法，差异显著，x2=12.012，p<0.05。

3 讨论

流感属于一类急性呼吸系统病症，其引起物质为病毒感染，患者患病大都会表现为高热、咳嗽等症状，流感病毒引起的疾病特点在于具有很强的传染性，很容易引发大规模的暴发流行疾病，而且潜伏期比较短，对公众健康造成极大的威胁。主要的流感类型包括甲、乙、丙三种，其中甲型流感比较常见。对人体健康造成的威胁最大，需要采取有效、及时的检测和控制措施。流感病毒具有很强的

课题名称：淄博市科学技术发展计划政策引导类，项目编号：（2015kj010040）

淄博市环境有机污染与人群健康监测分析重点实验室

致病能力，而且在传播的过程当中很容易发生变异，人们对于具有特异性的菌株没有必要的免疫力，很容易引起大范围的流感[2]。

在实验室中对流感病毒进行诊断最常用的方式通常是分离病毒和鉴定病毒。采取细胞培养法可以对流感病毒进行分离，从而保证流感病毒的抗原性以及原始标本处于一致的状态下，有利于进行长时间的储存，能够对病毒抗原性以及基因进行更好地分析。但是细胞培养法存在一些缺陷，主要是其所分离得出的病毒无法进行疫苗生产，并且进行细胞培养法检测时其检出率很容易被病毒载量被检样品的质量所影响，当被检测的样品质量不够高或者是病毒载量不足时，很容易出现假阴性的情况。同时，在对活体病毒进行检测时细胞培养法比较适用，因此采取该检测方法需要在收集、保存标本的过程中确保病毒的活性。实时荧光定量PCR是从传统PCR技术上不断进行发展得到的，属于一类新技术[3]，可以对核酸拷贝数量进行实时监测，具有很高的灵敏度，检测速度也比较快，检测过程中不容易受到污染，目前在病毒性病原体的检测中已经得到广泛应用。聚聚合酶链反应（PCR）可以对特定的核苷酸片的指数级进行扩增，当造成扩增反应后，对扩增物进行凝胶电泳定性分析，其中可以通过放射核素实施标记后光密度扫描，采取定量分析措施。实时定量PCR主要是对PCR扩增反应当中的每一个循环产物的荧光信号进行实时检测，在该过程中，定量以及定性分析起始模板到最后一个信号的收集，实时荧光定量PCR反应产物都会不断增多，荧光信号强度也会不断增强，每经过一个循环，就会收集到一个荧光信号强度，从中可以根据荧光强度的变化来观察产物量的变化状况，可以得到荧光扩增曲线图[4]。提取病毒RNA时采用实时定量PCR检测法用时大都在3小时左右，针对于流感病毒具有较高的特异性，可以对多株多压型的流感病毒进行识别，相对于血清诊断、特异性抗体检测等，该方法的特异性、灵敏性都比较高，有助于促使该类患者尽快得到确诊[5-6]。

本研究对实验室样本采取实际分析，应用实施荧光定量PCR技术对流感病毒核酸实施检测，结果显示，相比于细胞培养法检测，实时荧光定量PCR检测的检出率更好，可以对流感病毒进行准确、迅速地检测，但该方法在实施时需要具有较高条件的实验室，实验室需要有配备的特殊仪器以及操作人员也需要具备有较高的专业水平，样本留置时间不宜过长，在检测时要保证每一个环节都在标准范围内，而且还需要配合规范的仪器设备，才能得到准确的检测结果，为流感的控制提供可靠依据，否则难以实现有效检测。

参考文献

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