汪建红

（1.内江师范学院化学化工学院，四川 内江 641110；2.四川省高等学校果类废弃物资源化重点实验室，四川 内江 641110）

荸荠是一种较为常见的香甜可口、美味多汁、营养丰富的水果，我国的种植面积达到5 万hm2以上，年产鲜果百万t 以上，按照总荸荠质量的26%计算荸荠果皮质量，每年可产生26 万t 以上的荸荠皮[1-7]。这些荸荠皮往往得不到充分利用，造成巨大的浪费。荸荠皮营养丰富，富含多种功能成分，比如多糖、黄酮等[8-9]。多糖具有消炎、抗肿瘤等多种生物活性，提取荸荠皮中的多糖可使资源得到更充分的利用，实现经济价值最大化，也符合绿色环保的时代观念[10]。

提取多糖的常见方法有热水浸提法、超声波法、微波法、酶法等。热水浸提法[11]的提取效率较低，且提取物杂质含量较多。超声波法[12-15]和微波法[16-17]效率高，时间短，但都会对人体带来负面影响，危害人体健康。酶法[18-19]提取效率较高，但操作步骤多，还需要后处理，且酶易失活，部分酶还会导致多糖分解。内部沸腾法[20-21]是一种较新的提取方法，利用在细胞组织内部的沸腾使多糖更容易解吸进入溶液中，可快速高效的提取多糖，并且提取时间较短。因此本文采用内部沸腾法提取荸荠皮中多糖，并利用Box-Behnken 试验设计模型优化提取工艺条件，以获得较为准确的结果，为荸荠皮多糖的开发利用提供基本参考依据。

1 仪器与试剂

1.1 试剂

荸荠：四川内江东兴区农贸市场；葡萄糖、乙酸钠、乙酸、无水乙醇（分析纯）：成都金山化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

T-6 型紫外-可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；DF-101S 型恒温加热磁力搅拌器：郑州英峪予华仪器有限公司；TDL-5-A 型低速大容量离心机：上海安亭科学仪器厂；FA2204A 型电子天平：上海精天电子仪器有限公司；SHA-B 恒温水浴振荡器：金坛市汉康电子有限公司；DFT-100 型手提式万能高速粉碎机：温岭市林大机械有限公司；SHB-B95 型循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；CS101-2AB 型电热鼓风干燥箱：重庆试验设备厂。

2 材料与方法

2.1 试验材料

将荸荠取皮后洗净，在鼓风干燥箱中低温烘干后，粉碎备用。

2.2 标准曲线的绘制

按照文献方法[18-19，22]，以烘干至恒重的葡萄糖为原料设计方案绘制标准曲线，并得出在0.008 mg/mL～0.048 mg/mL 的浓度范围内的线性回归方程为A =33.4C-0.070 4，R2=0.999 4。

2.3 荸荠皮多糖的提取和测定

在圆底烧瓶中加入1.00 g 荸荠皮粉和5 mL80%的乙醇溶液，常温下浸泡 30 min，然后按照 20∶1（mL/g）的液料比加入一定pH 值和温度的水作溶剂，并保持在此温度下水浴回流一定时间，冷却，离心获取上层清液，将该清液转移到50 mL 容量瓶中，用水定容。

从此容量瓶中准确移取1.00 mL 提取液，稀释250倍，再准确移取1.00 mL 稀释液，利用6%的苯酚溶液和浓硫酸显色，显色后在490 nm 波长处测定其吸光度，并利用标准曲线计算得到的稀释液中多糖浓度，按照式（1）计算多糖得率。

2.4 单因素试验

在荸荠皮粉质量为1.00 g，乙醇浓度80%，乙醇体积 5 mL，液料比 20∶1（mL/g）的条件下，考查 pH 值（3、4、5、6、7）、提取温度（75、80、85、90、95 ℃）和提取时间（10、20、30、40、50 min）等单因素对多糖得率的影响。

2.5 响应面试验

根据单因素试验的结果，以pH 值A、提取温度B和提取时间C 为自变量，以多糖得率R 为响应值，采用Box-Behnken 设计法设计响应面模型，其中5个中心点试验，12个试因试验，并按照模型安排响应面试验，优化试验条件。

3 结果与讨论

3.1 单因素试验

3.1.1 pH 值对荸荠皮多糖得率的影响

pH 值对荸荠皮多糖得率的影响如图1所示。

图1 pH值的影响Fig.1 Influence of pH

从图1可看到，在3～7 范围内，随着pH 值的增大，多糖得率先增加后下降，在pH=5 时出现拐点。这是因为一定pH 值时，荸荠皮组织会变得较为脆弱，内部沸腾对荸荠皮的作用效果更好，有利于多糖解吸进入溶液中[23-24]。因此选择最佳pH 值为5。

3.1.2 提取温度对荸荠皮多糖得率的影响

提取温度对荸荠皮多糖得率的影响如图2所示。

图2 温度的影响Fig.2 Influecne of temperature

从图2可看到，随温度的增加，多糖得率先逐渐增加，然后逐渐降低，当温度为80 ℃时，得率达到峰值。这是因为，温度越高，分子运动越活跃，内部沸腾越剧烈，越有利于多糖解吸后扩散到溶液中；但温度过高时，对流扩散维持时间会缩短，由于多糖分子较大，扩散迁移较慢，会导致大量多糖在扩散出之前就已经造成了溶出通道的堵塞[23-24]。因此，选择最佳提取温度为80 ℃。

3.1.3 提取时间对荸荠皮多糖得率的影响

提取时间对荸荠皮多糖提取效果的影响如图3所示。

图3 时间的影响Fig.3 Influence of time

从图3可知，随时间的延长，多糖得率呈先逐渐增大后逐渐降低的趋势，且拐点出现在30 min 时。这是由于时间越长，就会有越多的多糖在内部沸腾作用下扩散到提取溶液中；但时间过长时，内部沸腾已接近于停止，扩散通道已近乎于堵塞，导致更多的多糖难以浸出，已经浸出的多糖也可能部分分解变质[23-24]。因此选择最佳提取时间为30 min。

3.2 响应面试验设计、分析及结果

3.2.1 响应面试验设计

根据单因素试验的结果，以pH 值A、提取温度B和提取时间C 为自变量，以多糖得率R 为响应值，采用Box-Behnken 设计法设计的响应面模型因素水平编码如表1所示，试验方案及结果如表2所示。

表1 响应面试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels used in response surface design

表2 关于多糖得率的响应面试验方案及其结果Table 2 Response surface design arrangement on yield of polysaccharide and the results

3.2.2 方差分析

利用Design Expert 8.05b 软件对数据进行分析，得出荸荠皮多糖得率对pH 值、提取温度和提取时间的二次多项回归方程为：

R=19.3-0.017A+0.42B-0.81C-0.065AB+0.57AC+1.04BC-1.88A2-0.76B2-0.56C2

方差分析见表3，可信度分析见表4。

从表3可看到该模型的P＜0.001，极显著，失拟项P＞0.05，不显著，说明该模型的方差均由随机误差引起。从表4可知该模型的R2=0.991 1，R2Adj=0.979 6，说明该模型拟合情况良好，回归效果也较好，可以解释99.11%响应值变化，未控制因素对试验结果影响较小（0.89 %）；且 CV=1.15 %，信噪比为 24.914，说明试验误差小，说明用此模型对多糖得率进行预测是可行的。

从表3还可看到一次项中B（温度）、C（时间）对多糖得率的影响极显著（P＜0.001），A（pH 值）的影响不显著；二次项中 AC、BC、A2、B2和 C2的影响极显著，AB的影响不显著。根据表中F 值的大小可知各因素影响先后次序为：C＞B＞A。

3.2.3 响应面图和等高线分析

各因素间交互作用的响应面图和等高线如图4～图6所示。

表3 拟合二次多项式模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of the fitted quadratic polynomial model

表4 回归方程可信度分析Table 4 Creditability analysis of regression equations

图4 温度、pH 值对多糖得率的影响Fig.4 Influence of temperature and pH on yield of polysaccharide

图5 时间、温度对多糖得率的影响Fig.5 Influence of time and temperature on yield of polysaccharide

从图4～图6还可看到pH 值、温度和时间之间存在交互效应，对多糖得率影响不是简单线性关系，从曲线上表现出来：时间影响使曲线更陡峭，温度次之，pH 值最平缓，该结论与方差分析表中的结果一致。

3.2.4 最佳试验条件的获得和验证试验

通过Design Expert 8.05b 软件对响应面结果的优化分析，得出荸荠皮多糖提取的提取工艺优化条件为：pH4.85，温度 78 ℃，时间 20 min，在该条件下多糖得率理论上可达19.72%，但考虑到操作的方便，将最佳工艺条件修正为pH 5，温度80 ℃，时间20 min，此时理论预测值为19.55%。在此条件下作5 次平行试验，得到荸荠皮多糖的平均得率为20.07%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为 3.45 %，与理论预测值的相对误差为2.66%。此结果与预测值接近，说明了此模型的可靠性。

图6 pH值、时间对多糖得率的影响Fig.6 Influence of pH and time on yield of polysaccharide

4 结论

将常作为垃圾被抛弃的荸荠皮作为提取多糖的原料，既提高了荸荠的利用价值，还可减少荸荠皮对环境的污染。本试验建立了利用内部沸腾法提取荸荠皮中多糖的工艺方法，并利用响应面模型对内部沸腾法提取荸荠皮多糖的工艺条件进行优化，得出其最佳条件为：pH 4.85，温度 78 ℃，时间 20 min，考虑到操作方便性，将条件修正为：pH 5，温度 80 ℃，时间 20 min，此条件下验证试验的平均得率为20.07%（RSD=3.45%），与该条件下理论预测值19.55%的相对误差为2.66%。该方法获得的多糖得率比相同条件下热水浸提法时的多糖得率17.57%高14.23%，说明了内部沸腾法的优点，是一种值得研究的方法。该结论为荸荠皮多糖的开发利用提供了一定的参考依据。