张艳军， 郭 荣

(浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004)

烟草赤星病是在烟草成熟期发生的一种真菌性叶斑类病害[1]，不但会影响烤烟产量、产值，还会影响烟叶的评吸质量[2].在我国，烟草赤星病在烟草产区发生较普遍，一般烟田发病率为5%～10%，重病田达10%～20%，严重发病田甚至可达50%以上，是烟草生产上威胁最大的病害之一[3].目前烟草生产中化学防治是防治烟草赤星病的重要措施，缺点是容易引起病原菌产生耐药性、造成农药残留和污染环境[4].随着对烟草及烟草制品安全性要求的提高，减少化学农药使用、生产绿色产品已经成为农业生产中新的发展方向.因此,生物防治越来越引起烟草界的关注.

筛选烟草赤星病菌拮抗菌是实施生物防治的一项重要工作，也是国内外科研工作者研究的热点，对于解决烟草生产中农药残留及环境保护方面都具有重要意义.研究以烟草赤星病菌为指示菌，通过琼脂块法和管碟法从土壤中筛选对烟草赤星病菌抑菌效果明显的拮抗菌株，进而对其进行分类鉴定和抗菌谱测定，同时对拮抗菌发酵液中抗菌活性物质稳定性进行研究，期望为后续分离纯化实验提供参考依据.

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株来源

烟草赤星病菌(Alternariaalternata)、杨树溃疡病菌(Dothiorelagregaria)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、小麦赤霉病菌(Gibberellazeae)、黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporium)、水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)均由安徽农业大学生命科学学院张应烙老师惠赠.

1.1.2 培养基

PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)和PD液体培养基组成见文献[5].鉴定培养基为固体淀粉培养基、糖发酵试验培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、Simons氏柠檬酸盐培养基、明胶培养基等[6].

1.2 方 法

1.2.1 烟草赤星病菌拮抗菌株的筛选

首先采用稀释涂布平板法[6]对采集土样中放线菌株进行分离纯化，将获得的菌株接种至试管斜面，并在4 ℃条件下保藏.采用琼脂块法[7]对分离得到的放线菌进行初筛，获得对烟草赤星病菌具有抑菌活性的拮抗菌株.最后采用管碟法[8]对初筛获得的拮抗菌株进行复筛，获得对烟草赤星病菌拮抗能力最强的放线菌菌株ZJNU968，用于后续实验.

1.2.2 烟草赤星病菌拮抗菌株的分类鉴定

菌株形态观察和生理生化测定参照文献[6]，同时对其16S rDNA序列进行测定，并运用软件MEGA 5.05按照Neighbour-Joining 法构建系统发育树，确定未知菌种的分类地位.

1.2.3 烟草赤星病菌拮抗菌株抗菌谱测定

烟草赤星病菌为真菌性植物病原菌，因此，利用管碟法考察了拮抗菌发酵液对其他真菌性病原菌，如杨树溃疡病菌、番茄早疫病菌、小麦赤霉病菌和黄瓜枯萎病菌的抑菌效果.为了考察拮抗菌是否能拮抗非真菌性植物病原菌，利用管碟法考察了拮抗菌发酵液对细菌性病原菌水稻白叶枯病菌的抑菌效果.

1.2.4 拮抗菌株发酵液抑菌稳定性测定

将斜面保藏的拮抗菌株接种至PDA平板，并置于28 ℃培养箱.5 d后用打孔器取直径6 mm的菌块至1.5 mL离心管，加入1 mL无菌水，洗下菌体和孢子，一并接入到250 mL摇瓶(含有30 mL PD液体培养基).将该摇瓶置于180 r/min,28 ℃的摇床中培养5 d，然后将发酵液转移至80 mL离心管中，并在10 000 r/min条件下离心15 min.所得上清液用于发酵液稳定性实验，其处理方法参见文献[5]，并采用管碟法检测抗菌活性，同时以原始无菌发酵滤液作为对照.

2 结果与分析

2.1 烟草赤星病菌拮抗菌株的筛选

从浙江省金华市婺城区采集的16份土样中筛选得到224株放线菌，以烟草赤星病菌为指示菌，采用琼脂块法筛选出6株具有拮抗作用的放线菌，其抑菌圈直径为1.20～2.90 cm.在此基础上，采用管碟法对初筛得到的6株拮抗菌株进行复筛，其中以菌株ZJNU968的抑菌效果最好，抑菌圈直径达到3.60 cm.因此，将该菌株用于后续试验.

2.2 拮抗菌ZJNU968分类鉴定

2.2.1 菌株形态特征

菌株ZJNU968在PDA培养基上菌落较小、圆形、微隆起、干燥、边缘整齐且不透明.菌落正面初期为白色，5 d后呈现灰色，菌落背面呈微黄色.该菌株气生菌丝和基内菌丝均很丰富，且有大量分枝，孢子丝呈螺旋状，孢子呈短圆柱形.

2.2.2 菌株生理生化特性

菌株ZJNU968淀粉水解现象明显，可以使明胶液化，能利用葡萄糖、乳糖生长.该菌株糖发酵试验(葡萄糖和乳糖)、甲基红试验、伏普试验、吲哚试验均为阴性，柠檬酸盐试验为阳性.

2.2.3 分子生物学鉴定

菌株ZJNU968的16S rDNA基因序列(1 443 bp)己提交至GenBank网站(基因库登录号为JX235956).从GenBank,EzTaxon等数据库调集链霉菌属相关菌株16S rDNA序列，并以青孢链霉菌(Streptomycesglaucosporus)为外群,按照N-J法构建系统发育树，如图1所示.菌株ZJNU968与StreptomyceslunalinharesiiRCQ1071[9]处于同一进化分支，二者序列相似性达98%，而且二者形态特征和生理生化特征基本一致.因此,确定菌株ZJNU968为Streptomyceslunalinharesii.

图1 系统发育树状关系图

2.3 拮抗菌ZJNU968抗菌谱测定

抗菌谱测定结果见表1.结果表明：StreptomyceslunalinharesiiZJNU968菌株发酵液对黄瓜枯萎病菌和水稻白叶枯病菌抑菌圈直径分别为2.95 cm和3.41 cm，同时对其他3种供试病原菌也有较强的抑制性.因此,ZJNU968菌株发酵液中含有的抗菌活性物质具有较为广谱的抗菌活性.

表1 ZJNU968菌株发酵液抗菌谱测定

2.4 拮抗菌株ZJNU968发酵液抑菌稳定性测定

2.4.1 热稳定性

由图2可知，拮抗菌发酵液中生物活性物质随温度升高而抑菌活性逐步下降.在30 ℃时，拮抗菌株ZJNU968发酵液对烟草赤星病菌的抑菌圈直径达3.80 cm，与对照相当；在50 ℃时，该菌株发酵液保持良好的抑菌效果，抑菌圈直径为3.10 cm；在90 ℃时，菌株ZJNU968发酵液抑菌活性显著下降，抑菌圈直径减至2.35 cm；在121 ℃时，发酵液抑菌活性全部丧失.因此,拮抗菌ZJNU968发酵液中抗菌活性物质具有较强的热稳定性，但高温会破坏其结构.

2.4.2 酸碱稳定性

拮抗菌株ZJNU968发酵液pH被分别调至2.77,3.48,4.34,5.26,6.12,7.16,8.28,9.22,10.30，其中5.26为原始发酵液的pH值.由图3可知：在pH 2.77～4.34时，抑菌圈直径略低于对照pH 5.26；在pH 5.26～7.16时，发酵液抑菌活性与原始发酵液相近；在pH 8.28下发酵液抑菌活性最强，随着pH进一步增加，发酵液抑菌活性均呈逐步下降趋势.因此,拮抗菌ZJNU968发酵液在pH 2.77～10.30时具有良好的稳定性.

*表示P< 0.05;**表示P<0.01

图3 pH对ZJNU968菌株发酵液抑菌活性影响

2.4.3 光照稳定性

由图4可知，在紫外光下照射1,2,4 h的ZJNU968菌株发酵液抑菌圈直径与对照相当.因此,紫外光照射对发酵液抑菌活性无影响.由图5可知，在自然光下照射3,6 h后的ZJNU968发酵液抑菌圈直径与对照接近，自然光照射9 h的发酵液抑菌圈直径略有下降，但仍有3.07 cm.因此,拮抗菌ZJNU968发酵液具有良好的光照稳定性.

3 讨 论

烟草赤星病于1892 年首先在美国发现,多次给世界烟叶生产带来较大的经济损失[10].在1916年，人们首次在北京地区发现了烟草赤星病，随后该病害在全国各地慢慢被报道.目前各地主要采用抗病育种、化学防治、生物防治、农业防治等方法防治烟草赤星病[11].目前,生物防治烟草赤星病是一种比较有效和发展潜力较大的防治方法，认为是目前最安全的防治措施，符合环境保护和有机食品发展要求[12].当前国内外学者对烟草赤星病菌拮抗菌的研究已经取得了一些成果.廉立慧等[13]采用对峙平板法从茄子根围土壤中筛选得到一株对烟草赤星病菌有明显拮抗作用的多产色链霉Q14，其抑菌带宽为1.45 cm，并且该菌株对黄瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌也有较强的拮抗作用.马志远等[14]从烟草表面及根际土壤中分离得到1株对烟草赤星病有拮抗效果的解淀粉芽孢杆菌M-07C2F，其抑菌条带宽度达1.42 cm.笔者利用琼脂块法和管碟法从土壤中筛选得到一株对烟草赤星病菌具有良好抑菌活性的菌株ZJNU968，同时该菌株具有较为广谱的抗菌活性，对其他5种供试病原菌皆具有较强的抑制活性.根据该菌株的形态特征、生理生化特征和分子生物学鉴定的结果，确定该菌株为Streptomyceslunalinharesii.目前研究表明，Streptomyceslunalinharesii对香蕉枯萎病[15]、短小芽孢杆菌LF-4[16]具有一定的抑制作用，但本研究所发现的Streptomyceslunalinharesii对烟草赤星病菌的抑菌活性尚属首次报道.

图4 紫外光对ZJNU968菌株发酵液抑菌活性影响

*表示P< 0.05

近年来发展形成的生物与化学协同控制植物病害策略，既能有效地控制病害的发生，又能降低化学药剂在农副产品中的残留，这就要求所用的抗菌活性物质要具有良好的稳定性，才能在与化学药剂混合使用中保持较高活性.本研究对ZJNU968菌株发酵液的抑菌稳定性研究结果表明：拮抗菌ZJNU968发酵液具有较强的热稳定性，但90 ℃以上的高温会对其活性造成严重影响；该拮抗菌发酵滤液在pH 2.77～10.30内具有良好的稳定性，同时也具有良好的光照稳定性.此外，拮抗菌ZJNU968所产生的抑菌活性物质对烟草赤星病菌的抑菌圈直径达到了3.60 cm，优于多产色链霉菌Q14(1.45 cm)、芽孢杆菌M-07C2F(1.42 cm)和枯草芽孢杆菌L3(1.70 cm)[17]，有望将其开发成一种新型生物农药，用于烟草赤星病的防治.目前本实验室正在对菌株ZJNU968发酵液中抗菌活性物质进行分离纯化和结构解析，后续还将进一步研究活性物质的抑菌机理和田间防治效果.