陶冉，谢露，郑君慧，谭小风，李诺，覃涛，杨叶桂，陈蒙华△

心 脏 骤 停（Cardiac arrest，CA）和 心 肺 复 苏（cardiopulmonary resuscitation，CPR）后诱发的心肌缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）可导致复苏后严重心脏收缩功能障碍，进而影响患者的预后，而心肌收缩功能与心肌能量代谢密切相关，改善复苏后心肌能量代谢可能有助于减轻复苏后的心肌IRI［1-2］。细胞的生存和增殖受细胞外调节激酶1/2（ERK）信号通路的调控，有研究表明，在心脏局灶缺血再灌注损伤模型中，ERK 通路的激活能够减轻心肌IRI［3］，而在多器官功能障碍的模型上，抑制ERK通路能够减轻器官功能障碍［4］。本课题组在前期研究中发现，通过抑制ERK通路的激活可以减轻实验大鼠神经细胞的IRI［5］。本研究拟在前期工作的基础上，进一步研究ERK 通路的抑制剂PD98059对CA/CPR后心肌IRI和心肌能量代谢的影响，探索改善复苏后心肌损伤的有效方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 36只SPF级SD大鼠，体质量200～250 g，不拘雌雄（由广西医科大学实验动物中心提供）。大鼠按随机数字表法分为假手术（Sham）组（n=6）、模型（CA）组（n=15）和PD98059（PD）组（n=15）。Sham 组只单纯行手术操作，不诱导CA/CPR；CA 组和PD 组诱导CA/CPR 并恢复自主循环（ROSC）后，PD 组立即静脉注射PD98059（0.3 mg/kg），CA 组立即静脉注射等量生理盐水。

1.1.2 仪器与试剂 生物机能实验系统BL-420F 购于四川成都泰盟仪器公司。小型动物呼吸机RWD407 购于深圳市瑞沃德生命科技有限公司。Odyssey 成像系统购于美国LICOR 公司。PD98059 购于美国Sigma 公司。心肌肌钙蛋白I（TNNI3）检测试剂盒购于武汉优尔生商贸有限公司。ATP检测试剂盒、BCA 蛋白质测定试剂盒（Beyotime Biotechnology，China，P0010）购于碧云天公司（中国上海）。磷酸化ERK（p-ERK）抗体、ERK抗体、GAPDH内参抗体均购于Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备 大鼠心脏骤停模型根据Chen 等［6］的研究施行。所有大鼠在术前禁食12 h，自由饮水。腹腔内注射10%水合氯醛（3 mg/kg）麻醉后、手术区备皮、消毒和行气管插管后，监测心脏节律。将2 根充满5 IU/mL 肝素钠盐水的20号导管分别植入大鼠左侧股动脉和左股静脉中。将压力传感器连接到BL-420F 生物机能实验系统并行心电和血压监测。在监测基础状态心电图和生理指数5 min 后，采用经食道交流电刺激诱导大鼠心脏发生心室颤动（VF）、建立CA/CPR后全心肌缺血再灌注损伤模型。CA成功判定标准：（1）平均动脉压（MAP）＜10 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）；（2）心电图呈直线、室颤波形或者心脏有心电活动但是无脉搏搏动。CA 6 min 后，立即行CPR，ROSC 的恢复标准：室性节律并伴MAP≥50 mmHg，且持续≥5 min 以上［6-7］。ROSC 之后，PD 组立即静脉注射PD98059（0.3 mg/kg），CA 组立即静脉注射等量生理盐水。继续监测生理指数1 h后放回笼中继续饲养。记录24 h内各组大鼠存活情况。于ROSC后24 h采集血样并分离血清200µL冻存于-80 ℃低温冰箱备用，将大鼠安乐死取左心室组织，一部分用于病理观察，一部分用于生化检测。

1.2.2 HE 染色病理观察 取各组复苏后24 h 心肌组织，经10%福尔马林液固定后，梯度乙醇脱水，石蜡包埋后制作4µm厚度切片，对切片进行脱蜡、覆水，常规HE染色，封片，光学显微镜下观察各组病理变化。

1.2.3 血清心肌肌钙蛋白I 检测 取ROSC 后24 h各组大鼠血清，使用心肌肌钙蛋白I检测试剂盒检测肌钙蛋白含量，操作方法按照试剂盒说明书进行。

1.2.4 ATP 含量的测定 取ROSC 后24 h 各组心肌组织，按照ATP检测试剂盒说明书检测ATP水平。

1.2.5 蛋白免疫印迹法检测p-ERK 的表达 取-80 ℃保存心肌组织，匀浆，离心取上清液，通过BCA蛋白质测定试剂盒进行总蛋白质浓度检测，然后与适量上样缓冲液混合，100 ℃煮沸5 min，完全冷却后，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并转移到PVDF 膜（0.22µm 孔径），然后用5%脱脂牛奶封闭。用含有0.1%Tween 20 的Tris 缓冲液（TBST）洗涤5 min×3 次后，与ERK1/2（1∶1 000）、p-ERK1/2（1∶1 000）和内参蛋白GAPDH（1∶1 000）孵育过夜，TBST 洗涤后，再与Anti-rabbit IgG 二抗（1∶30 000）进一步室温孵育2 h。通过3 次TBST 洗涤后，使用Odyssey 成像系统分析蛋白条带的光密度。条带用Image J软件定量，量化值以GAPDH的百分比表示。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0 软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间多重比较行LSD-t 检验。采用Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，Log-rank χ2检验比较各组累积生存率差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠24 h 生存情况比较 复苏后24 h Sham 组全部存活（6/6）、CA 组6/15、PD 组13/15，PD组24 h 累积生存率较CA 组显著提高（Log-rank χ2=12.533，P＜0.05），见图1。

2.2 HE染色病理结果 Sham组心肌组织细胞排列整齐，细胞核呈椭圆形，位于心肌细胞中央，胞质均匀；CA组心肌组织呈现肌原纤维断裂、排列紊乱，心肌细胞呈空泡变性，细胞质着色不均，胞核深染等病理性改变，细胞坏死明显。PD组心肌组织排列尚规则，细胞轻度水肿，细胞破坏程度明显减轻。见图2。

2.3 血清心肌肌钙蛋白I 水平 复苏24 h 后，与Sham 组相比，CA 和PD 组血清心肌肌钙蛋白I 水平显著升高（P＜0.05）；PD组血清心肌肌钙蛋白I水平较CA组明显下降（P＜0.05），见图3。

Fig.1 The comparison of cumulative survival between three groups图1 3组大鼠累积生存情况比较

Fig.2 The comparison of hematoxylin-eosin staining results between three groups（×400）图2 各组大鼠心肌组织HE染色结果（×400）

Fig.3 The comparison of the serum troponin I levels at 24 h of ROSC between three groups图3 复苏后24 h血清心肌肌钙蛋白I水平

2.4 心肌ATP含量的变化 复苏24 h后，CA组ATP含量明显低于Sham 组（P＜0.05）；PD 组ATP 含量明显高于CA组（P＜0.05），与Sham组差异无统计学意义，见图4。

Fig.4 The comparison of heart ATP contents at 24 h of ROSC between three groups图4 各组24 h心肌ATP含量的变化

2.5 大鼠心肌组织中p-ERK的表达 与Sham组比较，CA 和PD 组大鼠心肌组织中p-ERK 的表达水平明显升高（P＜0.05）；PD组p-ERK的表达水平较CA组明显下降（P＜0.05），见图5。

Fig.5 The expression of p-ERK at 24 h of ROSC in three groups图5 各组大鼠心肌组织中p-ERK的表达

3 讨论

恢复自主循环的心脏骤停患者全身器官组织都经历了一次缺血再灌注损伤打击，其中，心肌IRI 的严重性在一定程度上决定了患者能否长期生存［8］。室颤是临床上诱发心脏骤停最常见的原因。本研究采用电刺激法诱导大鼠发生心室颤动、建立CA/CPR模型，在一定程度上复制了临床情况。组织学和血清心肌损伤标志物的检测结果表明：6 min的心脏骤停时间足以造成明显的心肌IRI。ROSC的大鼠接受PD 治疗后，心肌病理损伤程度明显减轻，心肌损伤标志物肌钙蛋白I明显下降，提示PD98059能够改善心肺复苏后心肌能量代谢障碍和减轻心肌IRI，进而改善复苏大鼠的远期生存状态。

心肌IRI的产生机制非常复杂，诱发和加重心肌IRI的主要因素包括能量代谢障碍、细胞内外离子稳态失衡、乳酸酸中毒、心肌舒缩功能障碍、自由基、钙超载以及多种细胞激活的炎症反应等［9-10］。其中心肌能量代谢的主要物质来源是线粒体所产生的ATP。当发生IRI 时，细胞内线粒体功能障碍，因而ATP 的生产过程也会受到影响，最终导致ATP 产生不足，势必影响细胞的功能、代谢与生存［11］。有研究表明，心肌ATP的水平与其收缩能量呈正相关，而能量代谢的恢复能够减轻细胞损伤也已被证实［12］。实施亚低温治疗心肺脑复苏的重要保护机制之一就是减少细胞内ATP 消耗、增加其能量物质储备［13-14］。本研究结果显示，在复苏后24 h，CA和PD组大鼠心肌细胞ATP 水平较Sham 组明显降低，提示CA/CPR造成了心肌细胞损伤，进而致使ATP生成不足，导致心肌细胞能量代谢障碍。但给予PD治疗后，大鼠心肌ATP 水平显著升高。据此笔者认为PD98059 在CA/CPR 模型中可能通过发挥对心肌线粒体的保护作用，从而改善CPR 后心肌细胞的能量代谢水平和心肌IRI。

前期有大量研究显示ERK 通路的激活能够保护心肌细胞的IRI，但绝大部分基于心脏左前降支结扎的局灶损伤模型［15-16］；也有研究表明，ERK通路的抑制在多器官功能障碍的模型中具有保护作用［4］，而在心肺复苏模型上ERK 通路的作用尚不明确。本课题组前期研究发现，ERK 通路的抑制能够减少CA/CPR 大鼠模型脑细胞的凋亡，减轻大鼠脑IRI。本研究中亦发现ERK通路的抑制可以改善CA/CPR大鼠模型中心肌细胞损伤和能量代谢障碍，减轻其IRI。不同的实验模型和不同的实验条件可能是产生上述不同研究结果的重要原因，有待进一步研究验证。

综上所述，本研究采用的实验模型在一定程度上复制了CA/CPR后心肌IRI的病理生理过程，并且证明了复苏后早期应用PD98059能够改善心肺复苏后心肌能量代谢障碍和减轻心肌IRI。但本研究尚有不足之处，为了更好地保持实验的同质性，本次纳入的SD大鼠均属于正常健康大鼠，而室颤往往更常见于具有各类心脏基础病变的患者中，故不能完全反映临床的真实情况。