宋春红，马倩，甄娟，许红，刘洋，毕学杰△

胎膜在临产前自发性破裂称为胎膜早破（premature rupture of the fetal membranes, PROM）。胎膜早破导致早产发生率升高，宫内及产褥感染率皆增加，严重危害母婴安全。导致胎膜早破发生的原因众多，包括感染因素、社会因素及遗传因素等。宫内感染及由此导致的炎症反应在胎膜早破发生中发挥了重要作用［1］。核苷酸结合寡聚化结构域受体2 （nucleotide - binding oligomerization domaincontaining 2，NOD2）是固有免疫的胞质受体，能识别革兰阳性菌及阴性菌的肽聚糖，介导病原体所产生的炎症反应。目前对NOD2及其下游转导通路在胎膜早破发病中作用的研究较少。本研究检测了NOD2、基质金属蛋白酶（MMP）-9、活化型Caspase-3在胎膜早破胎膜组织中的表达及羊水中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平，探讨各分子表达的相关性，为胎膜早破的预防和治疗探索新的靶点。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年1月—2016年12月在石家庄市第四医院住院的产妇90 例。其中足月胎膜早破组（tPROM组，妊娠满37 足周）30 例，平均年龄（29.3±2.7）岁；未足月胎膜早破组（pPROM 组，妊娠不满37 足周）30 例，平均年龄（26.2±4.0）岁；正常妊娠晚期妇女（对照组）30 例，平均年龄（28.7±3.5）岁。各组均以剖宫产结束妊娠，无妊娠期糖尿病、妊娠期高血压综合征等产科并发症，且均为单胎初产，在临产前未接受抗生素治疗。胎膜早破的诊断标准参考全国高等学校教材《妇产科学》第7版。该试验经石家庄市第四医院医学伦理委员会批准，并取得孕产妇本人同意后取得标本。

1.2 标本采集 羊水采集：在行剖宫产术时切开子宫肌层、胎膜充分暴露后，取羊水5 mL，所取羊水均于室温下2 500 r/min离心5 min，取上清液，-70 ℃冰箱保存集中待测。胎膜采集：胎盘娩出后，立即取胎膜破口处全层胎膜组织5～10 g，以无菌0.9%氯化钠溶液漂洗干净，一部分组织吸干水分后置于冻存管中，-70 ℃保存、备用；另一部分于中性甲醛溶液固定后常规脱水、透明、石蜡包埋、切片。

1.3 主要试剂 兔抗人MMP-9单克隆一抗购自上海基因科技有限公司，小鼠抗人NOD2单克隆一抗购自美国Santa Cruz公司，兔抗人活化型Caspase-3 单克隆一抗、兔抗人β-actin单克隆一抗、TNF-α ELISA检测试剂盒购自武汉博士德生物工程公司，山羊抗兔/小鼠二抗购自上海基因科技有限公司。

1.4 免疫组织化学染色检测胎膜组织中NOD2、MMP-9及活化型Caspase-3 的表达 免疫组化染色采用SP 法。胎膜组织石蜡切片常规脱蜡至水，微波加热修复抗原；3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性；采用山羊血清于室温封闭；一抗4 ℃冰箱过夜，采用磷酸盐缓冲溶液（PBS）代替一抗作为阴性对照。隔日PBS 洗涤，滴加抗体增强剂，37 ℃孵育20 min；冲洗后二抗37 ℃孵育20 min，PBS 洗涤后，采用DAB 染色，于显微镜下控制染色强度；自来水冲洗，苏木素复染、盐酸乙醇分化、氨水返蓝；常规脱水、透明、中性树胶封片、镜检。检测NOD2、MMP-9及活化型Caspase-3在胎膜组织中的表达。以细胞膜/细胞质/细胞核出现明显的黄色或棕黄色为阳性，在显微镜下不着色或个别细胞浅着色等判读为阴性。

1.5 Western blot 检测 胎膜组织NOD2、MMP-9 及活化型Caspase-3 的表达水平 剪碎胎膜组织，加入细胞裂解液RIPA提取蛋白。检测蛋白浓度后，每孔上样60µg。行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，将目的蛋白转至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭，PBS 洗膜后，一抗4 ℃过夜，洗膜后加入二抗，37 ℃孵育1 h，用化学发光剂避光反应，将硝酸纤维素膜放至暗室中曝光显影。以β-actin 为内参照，目的蛋白与其相比进行半定量分析。

1.6 酶联免疫吸附法（ELISA）检测羊水TNF-α 水平 采用双抗体夹心ELISA测定羊水中TNF-α水平，操作方法严格按说明书进行。

1.7 统计学方法 采用SPSS 15.0 软件进行统计分析，符合正态分布的计量数据以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t 法，采用Pearson相关进行相关性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NOD2、MMP-9、活化型Caspase-3 在胎膜组织中的定位 免疫组织化学染色结果显示，NOD2、MMP-9、活化型Caspase-3 主要表达于胎膜组织羊膜上皮细胞和绒毛膜滋养细胞胞质，弱表达于蜕膜细胞胞质，MMP-9 还表达于中性粒细胞胞质，见图1。

2.2 各组胎膜组织中NOD2、MMP-9 及活化型Caspase-3 的表达水平 Western blot 结果显示，tPROM 组、pPROM 组NOD2、MMP-9 及 活 化 型Caspase-3 相对表达水平高于对照组（P＜0.05），pPROM 组NOD2 表达高于tPROM 组（P＜0.05），tPROM 组与pPROM 组MMP-9、活化型Caspase-3 表达水平相比差异无统计学意义，见表1、图2。

Fig.1 Expressions of NOD2,MMP-9 and activated Caspase-3 in fetal membranes(IHC,×100)图1 NOD2、MMP-9及活化型Caspase-3在胎膜组织中的表达（IHC，×100）

Tab.1 Comparison of relative expression levels of NOD2,MMP-9 and activated Caspase-3 proteins between three groups表1 各组相关蛋白相对表达量的比较 （n=30，±s）

Tab.1 Comparison of relative expression levels of NOD2,MMP-9 and activated Caspase-3 proteins between three groups表1 各组相关蛋白相对表达量的比较 （n=30，±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与tPROM组比较，P＜0.05

组别对照组tPROM组pPROM组F NOD2/β-actin 0.22±0.08 0.46±0.10a 0.52±0.08ab 95.563＊＊MMP-9/β-actin 0.98±0.21 1.28±0.15a 1.29±0.20a 27.660＊＊活化型Caspase-3/β-actin 0.27±0.08 0.68±0.10a 0.71±0.11a 191.230＊＊

Fig.2 Expression levels of NOD2,MMP-9 and activated Caspase-3 in fetal membranes of three groups图2 胎膜组织中的NOD2、MMP-9及活化型Caspase-3蛋白表达

2.3 各组羊水中TNF-α 水平 tPROM 组、pPROM组羊水TNF-α 水平分别为（34.48±13.32）ng/L 及（56.40±11.66）ng/L，较对照组（8.89±3.37）ng/L 明显升高（F=156.712，P＜0.01），pPROM 组水平高于tPROM组（P＜0.05）。

2.4 相关性分析 针对胎膜早破组的Pearson 相关分析显示，胎膜组织NOD2 表达水平与羊水TNF-α水平呈正相关（r=0.373，P＜0.01），与胎膜组织中MMP-9的表达呈正相关（r=0.412，P＜0.01），与胎膜组织中活化型Caspase-3 的表达呈正相关（r=0.448，P＜0.01）。

3 讨论

本研究显示，在胎膜早破患者，胎膜组织NOD2、MMP-9、活化型Caspase-3 表达及羊水TNFα水平升高，胎膜组织NOD2表达水平与羊水TNF-α水平呈正相关，与胎膜组织中MMP-9、活化型Caspase-3的表达呈正相关，表明NOD2及其下游信号转导通路分子激活/表达增加，在胎膜早破的发生发展中发挥了重要作用。

3.1 MMP-9 与胎膜早破 完整的胎膜可以阻挡病原微生物上行感染，从而维持羊膜腔的无菌环境。任何影响胎膜的完整性、弹性和张力强度的因素都可以导致胎膜早破［2］。MMP-9属于基质金属蛋白酶家族，是锌离子依赖的内肽酶，激活后主要形成Ⅳ型胶原酶，降解细胞外基质的明胶和Ⅳ、Ⅴ型胶原，在分娩发动及胎膜早破过程中发挥作用。宫颈阴道液体中MMP-9水平在妊娠前期处于较低水平，在妊娠37周后明显升高。在胎膜早破患者，血浆锌水平升高，羊水和血浆中MMP-9 水平增加，而血清及胎膜中Ⅳ胶原含量下降，表明血浆锌浓度增加导致MMP-9水平升高，从而降解胎膜组织中的Ⅳ胶原［3］。本研究直接检测了胎膜组织中MMP-9表达水平，发现其在胎膜早破组明显高于正常对照组。MMP-9水解胎膜组织的细胞外基质后，导致胎膜组织的脆性增加，尤其是在宫颈附近胎膜组织形成薄弱区，促进了胎膜早破的发生。

3.2 细胞凋亡与胎膜早破 细胞凋亡是一种基因控制的细胞自主性死亡过程，参与了许多疾病的发生发展。胎膜早破与细胞凋亡之间存在密切关系。胎膜早破患者胎膜组织中DNA 片段、Fas 及Caspase-8 表达增加，促凋亡蛋白Bax 及P53 表达增加，而凋亡抑制蛋白Bcl-2 表达减少［4］。Caspase-3位于凋亡信号转导通路的最末端，是细胞凋亡的最终执行者和特异性分子标记之一。本研究发现，胎膜早破患者活化型Caspase-3表达增加，胎膜细胞死亡增多，脆性增加，从而导致胎膜早破。其发生原因为宫内感染发生时，促炎细胞因子级联反应被激活，细胞因子如TNF-α 促进肿瘤坏死因子受体相关死亡域蛋白（TNFR-associated death domain protein,TFADD）表达，从而激活caspase基因表达，诱导细胞凋亡［5］。另外宫内感染发生时MMP 增加导致细胞外基质降解后，对细胞的形态和功能的支持作用丧失，胎膜细胞形态、功能发生改变，导致细胞凋亡。

3.3 TNF-α 与胎膜早破 TNF-α 是一种生物学功能广泛的多肽细胞因子，能够促进炎性反应，并能诱导细胞凋亡，是重要的炎性介质和免疫调节因子。在胎盘及其附属物中，蜕膜细胞、绒毛膜细胞、羊膜细胞及滋养细胞等也能产生一部分TNF-α。本研究表明，在胎膜早破患者羊水中TNF-α 水平升高，结合文献及本研究结果，TNF-α 导致胎膜早破的机制如下：（1）与肿瘤坏死因子受体1 结合后，通过激活转录因子NF-κB 及丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）途径诱导MMP-9 表达［6］，促进胎膜细胞外基质降解。（2）如上所述，TNF-α 与受体结合，募集TFADD，激活Caspase-8，最终激活Caspase-3 而发挥促细胞凋亡作用［5］。（3）MMP-9降解细胞外基质促进细胞凋亡，并通过裂解膜结合细胞因子如TNF-α进一步促进细胞凋亡，而凋亡又可诱导MMP-9激活，由此形成正循环促进胎膜早破的发生。（4）在体外培养羊膜细胞中，TNF-α促进上皮间质转化，降低羊膜破裂所需时间及机械压力，促进胎膜破裂［7］。

3.4 NOD2 与TNF-α、MMP-9、Caspase-3 及胎膜早破 NOD2 属于胞浆内NOD 样受体家族，作为胞内的模式识别受体，可以识别革兰阴性菌及阳性菌的胞壁酰二肽，可以抵御多种细菌，在宿主防御病原体中起到重要作用。NOD 信号转导可以激活NF-κB及MAPK 途径［8］，在调节基因表达及细胞功能活动中发挥重要作用。研究显示NOD2存在于妊娠相关组织，并发挥病理生理作用，妊娠早期蜕膜间质细胞表达NOD2，在配体胞壁酰二肽刺激下NOD2表达水平升高，蜕膜间质细胞分泌白细胞介素（IL）-1β 等促炎细胞因子，且蜕膜间质细胞凋亡增加［9］。胎膜早破患者胎儿体内NOD2 基因存在突变，表明参与固有免疫的基因突变在胎膜早破的发生中发挥了重要作用［10］。在体外培养胎膜组织中，NOD2 在配体胞壁酰二肽刺激下可以促进胎膜组织TNF-α 及MMP-9 分泌［11］。本研究显示NOD2 在胎膜早破患者胎膜组织中表达升高，且与TNF-α、MMP-9、活化型Caspase-3表达呈正相关，表明NOD2在胎膜早破发动过程中起到重要作用，与TNF-α、MMP-9、活化型Caspase-3表达相关，TNF-α又可以促进NOD2表达，并诱导MMP-9 产生及细胞凋亡，从而形成正反馈，促进细胞外基质降解和胎膜细胞凋亡，导致胎膜早破的发生。

综上，胎膜早破患者胎膜组织中NOD2、MMP-9、活化型Caspase-3 表达水平升高，羊水中TNF-α水平增加，四者表达存在关联作用，提示在胎膜早破发生发展中，NOD2信号转导途径激活，导致炎性细胞因子升高、胎膜细胞外基质降解及胎膜细胞凋亡，从而为胎膜早破的病因学研究提供了新的视角。