陈欧， 汤展宏， 胡军涛

广西医科大学第一附属医院重症医学科 (广西南宁 530021)

脓毒症是一种由感染引起的生理、病理和生化异常综合征，可导致器官损害并危及生命，最常见的病原菌是革兰阴性细菌，细菌表面的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)结构是诱导脓毒症产生的关键成分[1]。目前脓毒症的发病率呈逐年上升的趋势，虽然真正的发病率尚不清楚，但保守估计表明，脓毒症已经是全世界范围内造成死亡和危重病的主要原因[2-3]。其高昂的治疗费用以及对医疗资源的巨大消耗，严重影响了人类的生活健康、生存质量，对人类的生活造成了巨大的威胁。脓毒症炎症反应中因促炎因子和抗炎因子的调控、释放失衡，过度释放的炎症因子可以造成内皮细胞的损害和血管通透性的增加，从而导致血容量的丧失以及组织细胞水肿，从而引起包括肺组织在内的全身靶器官的损害，造成全身性炎症反应。其中急性肺损伤是脓毒症患者最常见的并发症及主要的死亡原因[4]。Toll样受体是哺乳动物中发现的第一类模式识别受体，是先天免疫系统和适应性免疫系统之间的重要纽带[5-6]。LPS作为革兰阴性菌表面的抗原物质，与Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)结合时可激活其下游信号传导通路，引起炎症介质的释放从而导致机体炎症反应[7-8]。2018年3—9月，本实验旨在研究TLR4在LPS诱导的脓毒症肺损伤中的作用及相关机制，以期为临床治疗提供新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 试剂与药品 LPS(美国Sigma公司)，戊巴比妥钠(上海西塘生物科技有限公司)，小鼠肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)ELISA试剂盒(艾美捷科技有限公司)，蛋白提取试剂盒(北京Solarbio公司)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京Solarbio公司)核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)多克隆抗体(美国Abcam公司)，β-actin多克隆抗体(美国Abcam公司)，山羊抗兔二抗(美国Abcam公司)

1.2 实验动物与分组 雄性普通小鼠(C57BL/10J)和TLR4 基因敲除小鼠(C57BL/10ScNJNJU)各16只，8周龄，体重 22～24 g，均购自南京大学-南京生物医药研究院，动物合格证号：SCXK(苏)2015-0001。在恒温恒湿，相同条件下适应性喂养1周，自由饮水，进食普通饲料，人工照明12 h/d。整个实验过程遵从动物实验伦理委员会要求进行。

按随机数字表法将小鼠均分为普通小鼠对照组(wild-type，WT组)、普通小鼠模型组(WT+LPS组)、TLR4基因敲除小鼠对照组(TLR4 knockout，TLR4-ko组)、TLR4基因敲除小鼠模型组(TLR4-ko+LPS组)，每组8只。模型组腹腔内注射20 mg/kg LPS[9]，对照组小鼠腹腔内注射等体积的生理盐水，24 h后在戊巴比妥钠麻醉下经内眦静脉采血后，用眼科剪剪开小鼠胸腔，将肺组织分离取出，放置于盛有生理盐水的培养皿中，洗净肺表面附着的血液，剪下小鼠右肺，浸泡在多聚甲醛中进行固定，留待后续做病理切片，余肺置于-80℃冰箱，留待检测肺组织中NF-κB蛋白含量。

1.3 方法

1.3.1 ELISA法检测小鼠血清中TNF-α含量变化 小鼠血液标本在4℃冰箱静置12 h，然后离心取上清液，置于-20℃冰箱保存，具体操作步骤参照ELISA试剂盒说明书进行，最后采用双波长读数，用酶标仪在450 nm和530 nm波长下分别测量各孔的吸光度值，以两者的差值作为最终的OD值。

1.3.2 肺组织病理形态学观察及肺损伤评分 肺组织在多聚甲醛中固定24 h后，依常规进行脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡处理后以HE染色，在光镜下观察肺组织病理学变化，并对肺损伤严重程度进行半定量评分：评分标准按照Smith评分体系[10-11]，依据肺水肿、肺泡及间质炎症细胞浸润、肺泡及间质出血、肺不张和透明膜的形成等5项指标分别进行肺损伤严重程度评分(0分为气管、肺泡及间质均正常；1分为损伤病变范围小于视野的25%；2分为损伤病变范围在25%～50%之间；3分为损伤病变范围在50%～75%之间；4分为损伤病变范围大于视野的75%)，总分16分，上述各项指标分数的总和即为肺损伤的总评分。

1.3.3 Western blot检测肺组织中NF-κB蛋白表达 从-80℃冰箱中取出冻存肺组织，用眼科剪尽量剪碎后放入裂解液，匀浆后收集上清液，用BCA法进行蛋白含量的检测。将样品稀释到合适浓度后进行PAGE凝胶电泳并转移到PVDF膜上封闭60 min，加入一抗NF-κB抗体，将膜在4℃下孵育过夜，然后与二抗孵育1 h。通过增强化学发光法观察条带，并在成像仪器中进行定量。其中β-actin作为内参。

2 结果

2.1 小鼠取材前一般状态 WT+LPS组小鼠出现活动度下降，倦怠少食，伴明显气促，眼鼻偶见脓白色分泌物等现象，有20%病死率；TLR4-ko+LPS组小鼠症状明显较轻；WT组及TLR4-ko组小鼠精神、进食、活动状况均未见明显异常。

2.2 各组小鼠肺组织病理学改变及肺损伤评分 (1)各组小鼠肺组织HE染色后光学显微镜下观察：WT+LPS组镜下肺泡腔内可见炎性细胞浸润、肺泡壁毛细血管扩张、充血明显，且伴有肺泡扩张不均匀，部分肺泡萎陷、破裂、融合，肺泡壁增厚、肺泡间隔的增宽，局灶性肺出血，偶可见透明膜形成；TLR4-ko+LPS组也可见轻度肺泡壁毛细血管扩张、出血，炎症细胞浸润，肺泡壁增厚的表现，但未见明显肺泡塌陷、破坏。WT组及TLR4-ko组肺泡形态大小正常，肺泡壁清晰可见，无肺泡紊乱和肺泡塌陷，肺间质中未见明显炎性细胞浸润。见图1。肺损伤评分：与WT组相比，WT+LPS组小鼠肺组织损伤评分显著增高(P<0.01)，TLR4-ko+LPS组与WT+LPS组相比肺损伤程度明显减轻(P<0.01)，WT组及TLR4-ko组肺损伤评分比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

A：TLR4-ko组；B：WT组；C：TLR4-ko+LPS组；D：WT+LPS组

2.3 血清TNF-α的表达水平 ELISA结果显示：与WT组比较，WT+LPS组小鼠TNF-α表达水平明显升高(P<0.01)；TLR4-ko组炎症介质表达差异无统计学意义(P>0.05) 。TLR4-ko+LPS组炎症介质表达较WT+LPS 组明显下降(P<0.01)。见表1。

项目n肺损伤评分(分)TNF-α(ng/L)WT组80.88±0.3513.57±1.51TLR4-ko组80.75±0.4614.12±1.31WT+LPS组86.12±0.99∗△80.68±19.05∗△TLR4-ko+LPS组82.62±0.91▲33.08±4.74▲F值92.92881.704P值0.0000.000

*与WT组比较P<0.01；△与TLR4-ko+LPS组比较P<0.01；▲与TLR4-ko组比较P<0.01

2.4 肺组织NF-κB蛋白的表达 蛋白条带可见，WT组小鼠肺组织仅有少量NF-κB蛋白表达，与WT组相比，WT+LPS组NF-κB蛋白表达水平明显上调(0.33±0.02vs. 0.66±0.01,P=0.000)。TLR4-ko组和TLR4-ko+LPS组中NF-κB蛋白表达水平差异无统计学意义(0.50±0.06vs. 0.52±0.04,P=0.597)。此外，WT+LPS组蛋白表达水平高于TLR4-ko+LPS组(0.66±0.01vs. 0.52±0.04,P=0.005)。β-actin为内参。见图2。

3 讨论

脓毒症是由于感染引起的全身性炎症反应，因宿主对感染微生物的复杂免疫、炎症反应，脓毒症常导致致命性休克、凝血障碍和多器官功能衰竭甚至死亡，临床上约半数的脓毒症患者常会并发肺损伤。 近年来尽管随着医疗水平的提高，专业重症监护和肺保护性机械通气策略的出现，在抗感染和支持性治疗方面取得了重大进展，但是很少有治疗方法在脓毒症肺损伤的管理中被证明是有效的，其仍然是重症监护病房住院和死亡的主要原因[12-13]。因此寻找有效的治疗策略去克服这一难题是具有重要临床意义的。

1：WT 组；2：WT+LPS 组；3：TLR4-ko 组；4：TLR4-ko+LPS 组

脓毒症并发肺损伤过程中涉及多种途径和机制，尽管国内外对其机制探讨进行了很多新的研究，如脓毒症时IQ模序的三磷酸鸟苷酶活化蛋白1(IQGAP1)及其信号转导所引起的肺血管内皮细胞通透性改变[14]，脓毒症介导交感神经兴奋毒性引起肺损伤炎症反应的发生发展[15]，但就目前研究而言，其免疫抑制机制尚未完全清楚。研究表明脓毒症并发肺损伤时中性粒细胞在肺内聚集活化，释放大量的炎症介质，并协同蛋白酶和活性氧对肺泡上皮细胞与肺毛细血管内皮细胞造成损伤，使肺泡毛细血管屏障受损，同时上皮损伤不仅有助于水肿液的积聚和促炎介质的产生，还会导致表面活性物质的产生和功能受损以及异常的液体转运，从而导致水肿液的清除受损，影响肺通气和换气功能，进一步加重肺损伤程度[16-18]。因此脓毒症肺损伤的发生发展主要是与促炎细胞因子的过度释放有关，治疗的关键就在于阻断炎症因子的大量释放。

研究表明，肺损伤发病的起始环节、炎症因子的大量释放与TLR4的表达、激活有着密切的关系[19-20]。并且TLR4/NF-κB信号通路是急性肺损伤发生、发展、转归的一个重要的信号通路。当LPS与免疫细胞表面的TLR4、CD14、MD-2组成的复合物结合后，可启动激活免疫细胞的信号转导通路[21-22]。免疫细胞，包括巨噬细胞和树突状细胞等的激活，通过TLR4胞内链接蛋白如髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)，激活白细胞介素-1(IL-1)受体链接蛋白激酶(IL-1 receptor associated kinase，IRAK)和信号分子肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor-associated factor 6, TRAF6)，启动炎症细胞转导通路，激活多种酶和转录因子，使下游NF-κB抑制性蛋白IκB磷酸化激活，NF-κB得以进入细胞核内调节多种基因的表达，有研究表明NF-κB的活化与急性肺损伤的发生密切相关[23]。通过这一系列的级联信号传递，导致单核巨噬细胞和中性粒细胞产生释放大量TNF-α、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-12(IL-12)等炎症介质并促进各种黏附分子的表达[24-25]，当大量炎症因子经血液循环流至肺部时，TNF-α等前炎症因子通过上调肺血管内皮细胞中E-选择素 、黏附分子等的表达，促进中性粒细胞的聚集，激活并释放大量的溶酶体酶、氧自由基等对内皮细胞造成直接的损伤，此外还可正反馈激活TLR4/NF-κB信号通路，引起炎症因子的爆发性合成释放。

在本实验中我们通过采取小鼠腹腔注射LPS的方法来复制脓毒症肺损伤模型。与WT组和TLR4-ko组小鼠相比，WT+LPS组小鼠肺组织病理改变明显，可观察到肺泡腔内炎性细胞浸润、充血明显，伴肺泡壁明显增厚，肺泡壁结构破坏、出血及透明膜形成；TLR4-ko+LPS组小鼠在光镜下观察可见轻微炎症细胞浸润、出血、肺泡间隔增厚，说明模型建造成功。且WT+LPS组与TLR4-ko+LPS组相比其肺组织损伤程度、肺组织NF-κB蛋白含量以及TNF-α表达水平明显增加，以上结果说明TLR4在内毒素所致的脓毒症肺损伤的发生发展过程中有着重要作用，且TLR4基因缺陷后可以抑制的脓毒症炎症因子的大量释放，并且对其并发的急性肺损伤有一定保护作用。

综上所述，内毒素感染引起的脓毒症可以并发急性肺损伤，这可能与细菌内毒素和免疫细胞结合后通过TLR4/NF-κB信号通路，引起炎症因子大量释放，并诱导激活肺泡巨噬细胞及中性粒细胞等炎症细胞在肺内聚集，造成组织损伤有关。敲除TLR4基因后，可以抑制TLR4/NF-κB信号通路，下调TNF-α的水平，从而减轻脓毒症的炎症反应，并可改善肺组织损伤情况。本研究通过TLR4基因敲除小鼠，明确了TLR4在LPS诱导的小鼠脓毒症肺损伤模型的发展过程中起重要作用，因此可以通过阻断TLR4信号传导通路来减少炎症介质的释放，从而为临床上脓毒症肺损伤的患者提供新的治疗靶点。