张玲，林荣，宋祖坤，王男，杨海麟*

1(江南大学,工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡， 214122) 2(苏州盛迪亚生物医药有限公司，江苏 苏州， 215000)

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)被广泛应用于血糖指标的临床生化检测。近些年发现葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase,GDH)具有替代葡萄糖氧化酶的应用潜力，因其不以氧气为电子受体，不受溶解氧的限制，检测结果误差更小[1-2]。葡萄糖脱氢酶按照辅基或辅酶差异可分为[3]：(1)以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(hicotinamide adenine dinucleotide, NAD(P)+)为辅酶的葡萄糖脱氢酶(NAD(P)-GDH,EC 1.1.1.47)。(2)以吡咯并喹啉醌(pyvrolidine quinoline quinone, PQQ)为辅基的葡萄糖脱氢酶(PQQ-GDH,EC 1.1.5.2)。(3)以黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)为辅基的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH，EC 1.1.99.10)。其中FAD-GDH以辅基结合紧密，催化效率较高，可作为替代目前诊断用葡萄糖氧化酶的首选。

具有活性的FAD-GDH可能为单体[4]或同源二聚体[5]。FAD-GDH主要来源于丝状真菌[6]，如：Penicilliumsp.[7]，Mucorsp.[8]，Aspergillussp.[9-10]，Glomerellacingulata[11]等，重组表达和纯化较为困难。来源于Glomerellacingulata的FAD-GDH在E.coli中重组表达，常常需要与分子伴侣系统共表达才能实现可溶性表达，蛋白纯化和放大生产较为困难[11]。在酵母菌中表达量较高，但存在糖基化修饰，会干扰血糖检测电极的灵敏度，实际生产应用中需进行酶的去糖基化步骤[12]。

FAD-GDH罕见于细菌。本团队先前尝试将来源于细菌Burkholderiacepacia的FAD-GDH基因(gdh)在大肠杆菌中表达，该酶热稳定性好，Tm值可达77 ℃。为了探索该基因在其他宿主的表达情况，本文尝试将来源于原核Burkholderiacepacia的gdh基因在枯草芽孢杆菌表达系统中表达。枯草芽孢杆菌作为表达宿主，遗传背景清楚，对培养基要求较低，生长快速，不产内毒素，适用于原核生物来源重组蛋白的分泌表达。

筛选高效的启动子可实现外源基因在枯草芽孢杆菌中高效表达。启动子依据是否需要诱导分为：(1)组成型启动子，如P43，PHpaⅡ，PamyQ’;(2)诱导型启动子，如Popuaa，Pgsib。组成型的启动子能在菌体内持续进行基因表达，受环境因素的影响较少，或变化很小。诱导型启动子在诱导因子存在下，相应的基因被激活，基因表达，积累目的产物[13]。许多研究表明双启动子相比单启动子更能促进外源基因的表达。重组菌株B.subtilisCCTCCM 2016536用于表达β-环糊精糖基转移酶，双启动子PHpaⅡ-PamyQ’表达系统的表达量是单个启动子PamyQ’表达系统表达量的1.3倍，主要由于双启动子下外源基因转录水平高于单启动子[14]。启动子PAmyR2和启动子Pblma分别插入PHpaII启动子的下游，4-α-葡聚糖转移酶的表达量和单启动子PHpaII比较分别提高11、12倍[15]。双启动子PHpaII-PgsiB表达氨肽酶分别是单个PHpaII和PgsiB启动子表达的2.3和2.2倍[16]。

将启动子突变改造也是提高枯草芽孢杆菌产物积累的有效办法。碳源代谢在菌体发酵过程中占有重要地位，表达外源产物的过程中碳代谢产物例如葡萄糖等，会对目的产物的生成产生抑制作用，即碳代谢产物抑制(carbon catabolite repression,CCR)，这种抑制作用主要是通过碳代谢控制蛋白A (carbon catabolite protein A,CcpA) 复合物结合到启动子区域的cre位点抑制转录[17]。cre位点的突变可有效地减少CcpA介导的碳代谢抑制作用。NICHOLSON等通过随机突变筛选得到抗碳代谢产物的淀粉酶生产菌株，经过测序发现amyE启动子的cre序列中GC碱基突变成AT[18]。NAGARAJAN等克隆来自高产淀粉酶的BacillussubtilisKCC103菌株的启动子amyR4，该启动子能够有效地抵抗碳代谢产物的抑制，实现异源蛋白的高效表达，序列研究表明启动子转录起始位点上游cre序列中+4(C-T)，-7(T-A)碱基发生突变[19]。

本研究尝试将Burkholderiacepacia的FAD-GDH基因(gdh)在蛋白酶缺陷型菌株B.subtilisWB600中进行表达，通过启动子筛选、串联及改造等策略，以期获得FAD-GDH高表达量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

葡萄糖脱氢酶基因(gdh)由南京金斯瑞合成，构建于载体pUC57；E.coliJM109，B.subtilis168，B.subtilisWB600菌株由实验室保存(表1)。

1.1.2 主要试剂

限制性内切酶、T4 DNA连接酶、rTaq DNA聚合酶、蛋白质Low Marker、DNA Marker均购自大连宝生物有限公司；PCR产物回收试剂盒；DNA凝胶回收试剂盒购自上海生工股份有限公司；其他所用试剂均购于国药集团药业股份有限公司。

1.1.3 培养基及缓冲液

(1) LB培养基(g/L)：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，加入2%(质量分数)的琼脂即为LB固体培养基。(2) TB培养基(g/L)：甘油4.0，酵母粉24.0，蛋白胨12.0，溶解在800 mL去离子水中，高压灭菌后冷却至40 ℃加入200 mL灭菌的缓冲液(K2HPO416.4 g，KH2PO42.32 g，溶解于去离子水中，定容至200 mL，0.22 μm的滤膜过滤除菌或高压灭菌)。(3) 抗 生素溶液：先配置成质量浓度为100 mg/mL的母液，然后用0.22 μm的滤膜过滤除菌，用小的EP管分装，置于-20 ℃ 保存。(4) 磷酸钾缓冲液(phospate buffered,PB，50 mmol/L， pH 7.0)：取86 mL的0.1 mol/L K2HPO4，加入14 mL的0.1 mol/L KH2PO4，再加入100 mL水，调节pH至7.0。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒pMA5-1的构建

以质粒pUC57-gdh为模板进行PCR扩增，引入BamHⅠ/MluⅠ位点，扩增产物回收双酶切，与同样双酶切的质粒pMA5连接，构建表达质粒pMA5-1。

1.2.2 串联启动子重组质粒的构建

以B.subtilis168的DNA为模板，利用引物PamyQ’-F/PamyQ’-R，P43-F/P43-R，PgsiB-F/PgsiB-R, Popuaa-F/ Popuaa-R，分别PCR扩增相应的启动子序列，同时引入NdeⅠ/MluⅠ位点，双酶切启动子序列与同样双酶切的质粒pMA5-1连接，构建双启动子质粒pMA5-1n(表2)。

1.2.3 培养方法

种子液的制备：从卡纳抗性的固体培养基上，挑取重组菌B.subtilis单菌落，接种到LB液体培养基，37 ℃，200 r/min摇床培养8 h。

表2 实验所用引物Table 2 Oligonucleotides used in this study

摇瓶发酵培养：以体积分数4%转接种子液于发酵培养基中，30 ℃，220 r/min，培养48 h。

1.2.4 菌体生物量测定

取20 mL不同浓度的菌液，8 000 r/min离心10 min， 用pH 7.0，50 mmol/L的PB缓冲液清洗2次，测定湿重，105 ℃烘干至恒定值，称取干重。菌体湿重约是干重的3.8倍。

1.2.5 葡萄糖脱氢酶酶活测定及SDS-PAGE分析

酶活定义：在一定条件下，每分钟还原1 μmol DCPIP所需的酶量定义为一个酶活单位。

取100 μL适当稀释的酶液，加入3 mL显色液(50 mmol/L pH 7.0的PB缓冲液， 0.03 mmol/L的DCPIP，1.6 mmol/L的PMS，100 mmol/L的葡萄糖溶液)轻轻混匀，用重蒸水调零，37 ℃每隔1 min记录600 nm处吸光值的变化，共记录2～3 min。

用酶的缓冲液代替酶液作为对照。

采用5%的浓缩胶与15%的分离胶，pH 8.3的Tris-Gly电泳缓冲液，90 V恒压，将剥离电泳后的胶，染色，脱色。胶的具体配置操作方法参照SDS-PAGE试剂盒。

1.2.6 基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱分析

样品处理：(1)用刀片切下胶上目标条带，放入离心管中；(2)加入400 μL脱色液脱色，清洗至透明，去除上清，冻干或加50 μL乙腈，放置5 min，去除乙腈，重复1次，晾干，胶粒应为白色；(3)加入90 μL 100 mmol/L NH4HCO3，10 μL 100 mmol/L DTT，56 ℃ 放置30 min； (4)去上清，加100 μL 100%乙腈，5 min后吸去；(5)加入70 μL 100 mmol/L NH4HCO3，30 μL 200 mmol/L IAA，暗处理20 min；(6)去上清，加入100 μL 100 mmol/L NH4HCO3，室温放置15 min；(7)去上清，加入100 μL 100%乙腈，5 min后吸去，冻干或加50 μL乙腈，放置5 min，去除乙腈，重复1次，晾干，胶粒应为白色；(8)加入6 μL酶液，4 ℃放置30～60 min，使胶块充分吸涨；(9)加入20 μL 25 mmol/L NH4HCO3缓冲液，37 ℃放置20 h左右；(10)取0.6 μL酶解液点样，自然晾干，覆盖0.6 μL基质，晾干。进行上机质谱分析，并将得到的结果导入NCBI网站比对。

2 结果与分析

2.1 重组质粒pMA5-1的构建表达及蛋白质谱鉴定

将gdh基因构建到pMA5上转入B.subtilis，研究是否能够表达具有活性的FAD-GDH。将pMA5-1转化E.coliJM109，经过氨苄抗性平板筛选，从阳性转化子中提取质粒，利用BamHⅠ和MluⅠ双酶切电泳验证，验证结果如图1，凝胶电泳条带与目的基因大小一致，并将验证正确的基因测序，与目的序列比对，结果表明构建成功。

M-DNA marker；1-pMA5-1双酶切产物图1 pMA5-1双酶切验证Fig.1 Identification of pMA5-1 by restriction digestion

将构建成功的质粒pMA5-1转入B.subtilis感受态WB600，从含有卡纳抗性的平板上挑选阳性克隆，获得重组菌株WB1，将获得的重组菌摇瓶发酵培养48 h，菌体离心收集，细胞破碎，上清离心，测得酶活为962 U/L，并将离心获得的上清取30 μL，加入10 μL 4×SDS-PAGE的上样缓冲液，煮沸10 min，进行SDS-PAGE检测，结果见图2，由于空白对照处也存在一条60 kDa的条带，所以将WB1破壁上清SDS-PAGE图谱中60 kDa处的条带切胶回收，进行飞行质谱分析，比对结果显示与目的条带匹配度最高的为来源于Burkholderiacepacia的葡萄糖脱氢酶，分子质量60 kDa，进一步表明FAD-GDH在B.subtilisWB600中表达成功。

M-蛋白质marker；1-对照；WB0-破壁上清；2-WB1破壁上清图2 B. subtilis表达FAD-GDH SDS-PAGE鉴定Fig.2 SDS-PAGE identification of B. subtilis expression FAD-GDH

2.2 串联启动子提高FAD-GDH的表达

采用双启动子串联策略来提高FAD-GDH的表达量，本文选取的启动子见表3。启动子PHpaⅡ是质粒pMA5上自带的启动子，本文选取其他4种启动子串联在PHpaⅡ下游构建含有双启动子。其中PamyQ’和P43为组成型的启动子，具有强启动性、无需添加诱导剂可直接产生目的蛋白的优势；PgsiB和Popuaa为盐诱导型启动子，受盐浓度激活调控目的蛋白大量产生的特点。4种双启动子表达质粒pMA5-11(PHpaII-PamyQ’)，pMA5-12(PHpaII-P43)，pMA5-13(PHpaII-PgsiB)，pMA5-14(PHpaII-Popuaa)构建流程见图3。

以B.subtilis168基因组为模板进行PCR扩增相应的启动子序列，扩增产物回收双酶切插入启动子PHpaII的下游，分别获得重组质粒pMA5-11，pMA5-12，pMA5-13，pMA5-14。利用NdeⅠ和MluⅠ双酶切电泳验证，验证结果如图4，并将验证正确的基因测序，与目的序列比对，比对结果表明构建成功。

分别将构建成功的质粒pMA5-11，pMA5-12，pMA5-13，pMA5-14，转化感受态B.subtilisWB600，从含有卡纳抗性的平板上挑选阳性克隆，获得菌株WB11，WB12，WB13，WB14，以及含有单启动子PHpaⅡ的重组菌WB1，将获得的上述重组菌与含有单启动子PHpaⅡ的重组菌WB1分别摇瓶发酵培养48 h，菌体离心收集，细胞破碎。

表3 本文所构建的来源于B. subtilis的启动子Table 3 The promoter from B. subtilis used in this study

图3 串联启动子载体pMA5-1n的构建流程Fig.3 Construction procedure of double promoter vector pMA5-1n

不同启动子的强度通过测定菌体胞内酶活来衡量。PamyQ’和P43为组成型的启动子[21-23]，PgsiB和Popuaa为盐诱导型启动子[24-26]，受盐浓度激活，可利用质量浓度为4 g/L的NaCl进行诱导表达。含单启动子PHpaⅡ重组菌株WB1及4种双启动子重组菌WB11，WB12，WB13，WB14的胞内酶活分别为924、2 497、 578、740、878 U/L(图5-a)。其中含有组成型启动子PamyQ’的双启动子重组菌WB11 (PHpaⅡ-PamyQ’)胞内酶活最高，约是酶活最低的重组菌株WB12的4倍，是单启动子PHpaⅡ表达FAD-GDH酶活的2.7倍。分别取30 μL上述离心获得的上清加入10 μL 4×的上样缓冲液，煮沸10 min，进行SDS-PAGE检测，结果见图5-b， 重组菌发酵液在60 kDa处都有目的蛋白产生。

M-DNA marker；1-pMA5-11双酶切产物；2- pMA5-12双酶切产物；3-pMA5-13双酶切产物；4-pMA5-14双酶切产物图4 双启动子载体pMA5-1n双酶切验证Fig.4 Identification of double promoter vector pMA5-1n by restriction digestion

a-含双启动子重组B.subtilis产FAD-GDH的酯活水平和菌体量；b-含双启动子重组B.subtilis表达FAD-GDH的SDS-PAGE鉴定M-蛋白质marker；1-WB1破壁上清；2-WB11破壁上清；3-WB12破壁上清；4-WB13破壁上清；5-WB14破壁上清图5 双启动子表达FAD-GDH结果及SDS-PAGE鉴定Fig.5 Result of double promoter expression FAD-GDH and SDS-PAGE identification

2.3 删除启动子PamyQ’上cre位点促进FAD-GDH的发酵产酶

上述研究中表明最佳的串联双启动子PHpaII-PamyQ’使酶活提高到2 497 U/L，具有促进该酶表达的效果，但有研究表明PamyQ’启动子在发酵过程中会受到葡萄糖浓度的抑制，随着葡萄糖浓度的增加会明显抑制产酶[14]。本研究先考察葡萄糖是否会严重抑制串联启动子PamyQ’突变菌株的发酵产酶。比较不同浓度的葡萄糖和甘油条件下该突菌变株的发酵产酶情况。

将改造前重组菌WB11(含有双启动子PHpaII-PamyQ’)发酵培养48 h，收集菌体，酶活验证是否存在碳代谢产物抑制效应。结果如图6，通过测定酶活检测FAD-GDH的表达情况，随着培养基碳源的葡萄糖或甘油浓度的增加，菌体量上升，酶活逐渐下降。未添加葡萄糖，菌体胞内酶活是添加30 g/L的葡萄糖培养菌体胞内酶活的1.5倍；当未添加甘油，胞内酶活是添加3%(体积分数)的甘油胞内酶活的2倍，说明串联启动子PamyQ’后碳源浓度增加会抑制产酶。

a-不同质量浓度葡萄糖对改造前后重组菌产酶的影响；b-不同体积分数甘油对改造前后重组菌产酶的影响图6 改造前后重组菌产FAD-GDH水平及菌体生长情况Fig.6 FAD-GDH expression and cell growth of reconstituted bacteria before and after transformation

枯草芽孢杆菌中，碳代谢产物的抑制效应主要是通过碳代谢控制蛋白CcpA，结合到启动子区域的cre位点抑制转录。cre位点是一段含有回文结构，存在一些碱基保守的序列。CcpA如何与多样的cre位点结合，具体的机制还不清楚，但改造和移除该位点可有效减少碳代谢的抑制[18-19]。

为了减少碳代谢产物的抑制效应，基于双启动子PHpaII-PamyQ’，通过重叠延伸PCR[27]移除PamyQ’启动子中14个核苷酸的cre位点，构建双启动子PHpaII-PamyQ2，转入B.subtilisWB600，构建WB2重组菌，发酵培养基添加30 g/L的葡萄糖，菌体胞内酶活力达3 626 U/L， 约是启动子改造前添加30 g/L的葡萄糖菌体胞内酶活的2.2倍。如图7-b重组菌株WB2发酵培养基中添加2%(体积分数)的甘油菌体胞内酶活力达3 119 U/L，是改造之前重组菌株WB11添加2%的甘油菌体胞内酶活的2.1倍。重组菌株WB111发酵培养中添加3%的甘油胞内酶活比添加2%的甘油有所下降，可能是过多的碳源导致菌体生长过快，抑制重组蛋白表达。

为了验证改造后的重组菌WB2，培养时添加高浓度的葡萄糖是否会抑制FAD-GDH的表达，向培养基中分别添加40、50、60、70 g/L的葡萄糖，测定破碎菌体上清中的酶活及菌体干重，结果如图7，随着葡萄糖浓度的上升，菌体干重趋于稳定，可能是菌体生长受到溶解氧浓度的限制，胞内酶活随着葡萄糖浓度上升而下降，过快的生长速度导致质粒丢失。培养基添加30～40 g/L的葡萄糖，一定程度上促进菌体生长及酶的表达，删去启动子PamyQ’的cre位点可减少碳源代谢产物对基因转录的抑制，促进外源基因表达。

图7 高浓度葡萄糖对改造后重组菌WB2生长及FAD-GDH表达的影响Fig.7 FAD-GDH expression and cell growth of recombinant WB2 with more glucose

3 结论

构建含有单启动子PHpaⅡ的重组质粒pMA5-1，转入B.subtilis，测定酶活及飞行时间质谱鉴定表明重组菌表达了具有活性的FAD-GDH。分别选取2种组成型启动子(PHpaⅡ-PamyQ’，PHpaⅡ-P43)和两种盐诱导型启动子(PHpaⅡ-PgsiB，PHpaⅡ-Popuaa)串联成双启动子分别表达FAD-GDH，含组成型双启动子PHpaⅡ-PamyQ’的重组B.subtilis，胞内表达量最高为2 497 U/L，PHpaⅡ-PamyQ’双启动子表达强度增加可能是由于转录强度增加。本实验中采用的其他双启动子表达FAD-GDH的活性低于单启动子，可能是启动子之间的排列顺序会影响启动之间的相互作用，靠近异源基因的启动子可能会更大程度地影响外源基因的表达[28]。在PHapII与gdh基因之间插入不同的启动子后，其RBS也被随之替换为新插入启动子的RBS，因此酶活性的变化也很有可能是由于翻译强度的变化引起的。

发酵过程中，发现葡萄糖和甘油会抑制串联启动子PamyQ’突变株的发酵产酶，存在碳代谢产物抑制效应。为了减少发酵中的碳代谢抑制，采取删去PamyQ’启动子中与碳代谢阻遏因子结合的cre位点，构建的含有缺失cre位点的双启动子PHpaⅡ-PamyQ2重组B.subtilis，使FAD-GDH酶活从2 497 U/L提高到3 626 U/L， 说明启动子PamyQ’中cre位点的删除有效地减少了碳源代谢产物对基因转录的抑制，促进外源基因表达。