王一茜，荣金诚，王晓辉，迟乃玉，张庆芳*，李美玉

1(大连大学 生命科学与技术学院，辽宁 大连，116622)2(辽宁省海洋微生物工程技术研究中心，辽宁 大连，116622)

利用方差分析、相关性分析等数据分析方法，张庆芳等[19]推导出了乳酸菌对亚硝酸盐的降解分为NiR降解和酸降解 2个阶段。在发酵的前期，培养液pH>4.5时，乳酸菌对亚硝酸盐降解以NiR降解为主；发酵后期，由于乳酸菌本身产生酸，使培养液pH值降低，pH<4.0后，亚硝酸盐的降解主要以酸降解为主。由于乳酸杆菌产酸能力强于乳酸球菌，乳酸杆菌降解亚硝酸盐能力大于乳酸球菌，而在发酵前期(pH>4.5)，杆菌与球菌降解亚硝酸盐并无差别。

1 材料与方法

1.1 亚硝酸盐降解研究

1.1.1 试验菌种

Lactobacillusbrevis1508；Lactobacillusplantarum1407；Lactobacillusrhamnosus1.11，以上菌株为本研究室保藏。

1.1.2 蔬菜原料

大连市郊区甘蓝。

1.1.3 培养基及培养液配方

MRS固体培养基(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨10、酵母粉4、K2HPO42、牛肉粉8、MgSO40.1、乙酸钠5、柠檬酸三铵2、MnSO40.05、吐温-80 1、琼脂20、pH 7.2。

液体培养基：不加琼脂，其他成分同MRS固体培养基。

1.1.4 菌种活化

菌种活化培养基为MRS液体培养基。一次活化：取纯化后穿刺保藏的各菌种试管，分别穿刺3针接于10 mL液体培养基试管中，重复3次，30 ℃培养48 h。二次活化：取一次活化各菌种菌液，按10%接种量接种于液体培养基扩大培养，30 ℃培养48 h。

1.1.5 仪器与设备

HD-1360超净工作台，北京悦泰行科技发展有限公司；THZ-312台式恒温振荡器，上海精胜科学仪器设备有限公司；280型轻便手提压力蒸汽消毒器，成都一科仪器设备有限公司；BZ-01显微镜，德国徕卡；UV-120-02紫外可见分光光度计，上海珂淮仪器有限公司；pHB-4p酸度计，上海升隆公司。

1.1.6 蔬菜发酵工艺流程

甘兰→清洗→烫漂→沥水→切段→装瓶→压石→注盐水→接种→密封→发酵

1.1.7 测定指标及方法

1.2 参考序列

菌株的16S rDNA序列下载自NCBI核酸数据库，包括L.bifermentans[M58809.1]，L.brevis[NR_044704.1]，L.composti[NR_041509.1]，L.coryniformis[NR_044705.2]，L.plantarum[D79210.1]，L.rhamnosus[M58815.1]，L.similis[KJ547681.1]。

乳杆菌的亚硝酸盐还原酶蛋白序列下载自NCBI蛋白数据库，包括L.bifermentans[WP_057904912.1]，L.brevis[WP_035444188.1]，L.composti[WP_057003017.1]，L.coryniformis[EJN56181.1]，L.plantarum[AKC01517.1]，L.similis[WP_057151639.1]。此外，经详细搜索比对发现，菌株L.rhamnosus的亚硝酸盐还原酶基因在网上数据库中无序列信息。

1.3 数据库和分析软件

GenBank数据库：核酸序列数据库，包含基因核酸与蛋白序列、非编码序列、基因组序列等，由美国国立生物技术信息中心(NCBI)建立并维护；BLAST(序列局部比对工具，有blastp、blastn、blastx、tblastn、tblastx五种比对方法)；Clustal X2(多序列比对工具)，MEGA5(系统发育分析软件)，BioEdit(序列比对与分析工具)，蛋白保守结构域由NCBI的CDD预测。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌发酵产酸特性

图1 无培养液中总酸的变化Fig.1 The change of culture medium (without total acid produced

图2 无培养液中pH值的变化Fig.2 The change of pH in culture medium broth without

图3 有培养液中pH值的变化Fig.3 The change of pH in culture medium broth with

图4 蔬菜发酵液的pH变化Fig.4 The change of pH in vegetable fermented solution

图5 蔬菜发酵液的总酸、挥发酸含量Fig.5 The change of total acid and volatile acid content of vegetable fermented solution

图6 发酵菜的总酸含量Fig.6 The change of total acid of vegetable fermented solution

2.2 乳酸菌基因分析

2.2.1 亚硝酸盐还原酶基因的深入分析

基于NCBI数据库，本研究对L.rhamnosus、L.plantarum、L.brevis所有可获得的基因组进行了分析，通过基因组功能注释查找nir基因，并利用BLASTP比对参考序列(NiR蛋白序列)，发现L.brevis与L.plantarum菌株中存在nir基因，而L.rhamnosus菌株中未发现该基因。

进一步的多序列比对结果可看出(图7)，除L.plantarum外，其余5株乳杆菌的亚硝酸盐还原酶的蛋白序列的相似性很高(相似性在80%以上)，只在蛋白序列的前端与末端存在较高比例的差异氨基酸。蛋白质的保守结构域分析(CDD分析)也表明，乳杆菌(除L.plantarum外)的亚硝酸盐还原酶均包含1个NiR_SIR_ferr超家族结构域，该结构域为亚硝酸盐/亚硫酸盐还原酶的保守结构域家族。而且，该结构域的氨基酸序列(占全酶序列长的86.9%)在6株乳杆菌中是高度保守的，与多序列比对的同源性较高的区域相一致，这表明在历史进化中NiR_SIR_ferr超家族结构域的稳定遗传决定了亚硝酸盐还原酶的稳定存在与功能实现。

图7 L. plantarum、L. brevis与其他乳杆菌的亚硝酸盐还原酶蛋白序列的多序列比对与结构域分析Fig.7 The multiple sequence alignment of the nitrite reductase protein sequence and the domain analysis of L. plantarum, L. brevis and other Lactobacillus

2.2.2 系统发育分析

如图8-A所示，基于6株乳杆菌(包括L.rhamnosus)的16S rDNA序列构建的系统发育树分化为2个明显的大分枝，L.rhamnosus与L.bifermentans、L.coryniformis与L.composti在同一大分枝上，L.plantarum、L.brevis与L.similis在同一大分枝上，而同一大分枝上的菌株的亲缘关系更近，也即L.plantarum与L.brevis亲缘关系更近。

A-16S rDNA序列; B-系统发育树图8 基于L. plantarum、L. brevis、L. rhamnosus与其他乳杆菌的16S rDNA序列与亚硝酸盐还原酶蛋白序列构建的系统发育树Fig.8 The phylogenetic tree built based on Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus rhamnosus and other Lactobacillus 16S rDNA sequences and the nitrite reductase protein sequence注：系统发育树由MEGA5构建，采用Neighbor-Joining方法，重复500次建树，进化距离由p-distance方法运算获得。

然而，基于亚硝酸盐还原酶蛋白序列构建的系统发育树上(图8-B，不包括L.rhamnosus)，L.plantarum所在的进化分枝独立于其他菌株，这与16S rDNA序列构建的系统发育树明显不同。而且，由图8-B可知，L.plantarum的亚硝酸盐还原酶基因在历史进化中最先分化，且在长期进化过程中形成了独特的亚硝酸盐还原酶基因结构。

2.3 乳酸菌发酵降解亚硝酸盐的能力

图9 培养液含量变化Fig.9 The change of content of in culture solution

图10 蔬菜发酵液中含量变化Fig.10 The change of content of in vegetable fermented solution

图11 发酵菜中残留量Fig.11 Residual of fermented vegetable

3 讨论

张庆芳等[19]推导出了乳酸菌对亚硝酸盐的降解分为NiR降解和酸降解 2个阶段。在发酵的前期，培养液pH>4.5时，乳酸菌对亚硝酸盐降解以NiR降解为主；发酵后期，由于乳酸菌本身产生酸，使培养液pH值降低，pH<4.0后，亚硝酸盐的降解主要以酸降解为主。

本实验室及其他学者[33-37]均发现L.rhamnosus有降解亚硝酸盐的能力。但经详细搜索基因库发现，菌株L.rhamnosus的亚硝酸盐还原酶基因在网上数据库中无序列信息。可能原因如下：(1)L.rhamnosus有nir基因，但国内外无相关研究。见图9，在亚硝酸盐纯培养液发酵前期(非酸降解阶段)有大量亚硝酸盐被降解；由图10和图11可知，蔬菜原料中有大量硝酸盐被分解使得发酵环境中有大量亚硝酸盐生成，随后亚硝酸盐被大量降解。(2)L.rhamnosus没有nir基因。如图9亚硝酸盐在前期(pH>4.5)又有降解，可能是此菌产生的乳酸菌素[38]等其他物质作用(如乳酸菌素最适作用pH为2～8，涵盖了NiR降解阶段)；但此菌降解亚硝酸盐能力较强(见图10)，L.rhamnosus是正型发酵，见发酵产酸特性3.1的分析，其产酸能力较强，且降解亚硝酸盐可能是氮代谢途径[39-42](如果有亚硝酸盐还原酶)，不能使其发酵环境的pH值回调，使其快速降到4.0以下，进入酸降解阶段。