杨康卓，赵 东，郑 佳，张建敏，刘 芳

（宜宾五粮液股份有限公司技术研究中心，四川宜宾644007）

大曲是白酒发酵的糖化剂和发酵剂，同时，培曲过程中由于微生物代谢产生的大量风味物质及相关前体物质在拌和酒醅、发酵过程中直接或间接进入酒醅，经酒醅发酵、蒸馏后会显著影响产品的香味风格特征，因此大曲也是一种生香剂[1]。五粮液生产使用的“包包曲”，属浓香型大曲，按品温来划分则为中偏高温大曲。它是以粉碎的纯小麦为原料，压制成带有鼓包形状的砖块状曲坯，在一定温度及湿度条件下发酵而成的，具有独特的香气特征[2]。

固相微萃取-气质联用技术(SPME-GC/MS)是目前研究大曲挥发性组分的最常用的方法。范文来等[3]在浓香型大曲中检出了112种微量挥发性组分；陈勇等[4]在泸州老窖高温大曲中检出了34种挥发性组分；赵东等[5]从五粮液包包曲中定性出68种挥发性成分，主要以杂环类化合物为主。但是，由于包包曲制曲过程是一个动态的过程，制曲过程中香气成分往往随着微生物群落结构的演替而发生显著的变化，因此，研究发酵过程曲坯中香气成分的变迁规律对调节工艺参数、改善曲块质量具有重要现实意义。

本研究利用SPME-GC/MS技术分析了包包曲发酵过程中的挥发性成分，结合质谱匹配度、保留指数和标准物质等进行成分的定性，获得了较为全面的五粮液“包包曲”挥发性成分数据库，为大曲质量标准的建立和探讨大曲对酒质的影响提供了数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品采集

包包曲样品采集自五粮液股份有限公司制曲车间，分别取发酵期为0 d、3 d、7 d、14 d、30 d(即发酵完成后出房的成品曲)的大曲样品。所有样品在实验室粉碎混匀，制成曲粉于-20℃下保存。

1.1.2 试剂和仪器

C7—C30直链正构烷烃、3-甲基-3-己醇、3-苯基-2-丁烯醛、萘、2-甲基吡嗪，购自美国Sigma-Aldrich公司。(E)-2-庚烯醛、(E,E)-2,4-己二烯醛、(E)-2-辛烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛,(E)-2-壬烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、己醛、壬醛、癸醛、乙酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、(E)-2-己烯酸己酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯、己酸己酯、癸酸乙酯、琥珀酸乙酯、十一酸乙酯、月桂酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、十五烷酸乙酯、棕榈酸乙酯、十七酸乙酯、硬脂酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯、4-辛酮、乙偶姻、异丁醇、异戊醇、己醇、1-辛烯-3-醇、庚醇、正辛醇、2,4-己二烯-1-醇,苯甲醛、苯乙醛、苯甲酸乙酯、苯乙酸甲酯、苯乙酸乙酯、愈创木酚、苯丙酸乙酯、苯乙醇、3-苯基-2-丁烯醛、苯酚、4-乙基愈创木酚、甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、2-戊基呋喃、糠醛、糠醇、β-石竹烯、乙酸、己酸、γ-丁内酯、γ-己内酯、γ-壬内酯，购自TCI(上海)公司。

固相微萃取手柄和50 μm CAR/DVB/PDMS纤维萃取头，购自美国Supelco公司。气质联用仪为7890B-977B，购自美国Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 萃取头老化

各类型萃取头在首次使用之前均需要在热条件下老化，老化程序参考Supelco配件盒内老化指南。

1.2.2 萃取条件

称取1 g大曲粉于20 mL顶空样品瓶中，置于60℃水浴中平衡15 min，插入萃取头吸附挥发性成分40 min，随后插入GC进样口热解析3 min，分析其中挥发性成分。

1.3 GC-MS条件

利用配备了极性色谱柱DB-WAX(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)的GC-MS分析包包曲粉中的挥发性成分。

气相色谱条件：进样口温度250℃，载气(He)流速1 mL/min，不分流模式进样；气相色谱升温程序：起始炉温40℃，保持5 min，以4℃/min升至230℃，保持15 min。

质谱条件：质谱EI源，电子轰击能量70 eV；离子源温度200℃，四级杆温度150℃，质量数扫描范围35～350 amu。

1.4 物质鉴定

挥发性成分的鉴定采用参考文献[6]的方法：即先将化合物与NIST08标准数据库进行比对，匹配度＞800(最大值1000)，作为初步定性结果；再计算各物质的Kovats保留指数(RI)[7]，并与文献报道的保留指数值进行比较。同时，与标准品在相同色谱条件下的保留时间对比，最终确定该物质的归属。

2 结果与分析

2.1 不同发酵时期包包曲挥发性成分总离子流图（见图1）

本研究分析了包包曲发酵过程中的挥发性成分（图1），共鉴定出137种挥发性成分，其中醛类19种、酯类40种、酮类8种、醇类15种、芳香族22种、吡嗪类12种、呋喃类7种、酸类3种、内酯类3种、萜烯6种、其他物质2种。

2.2 醛类（表1）

由表1所示，共检出醛类化合物19种，其中不饱和醛最多(14种)，其次为直链饱和醛(4种)和支链饱和醛(1种)。

不饱和醛包括(E)-2-丁烯醛、2-甲基-戊烯醛、3-甲基-2-丁烯醛、2-乙烯基-2-丁烯醛、(E)-2-庚烯醛、(E,E)-2,4-己二烯醛、(E)-2-辛烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、2,4,6-辛三烯醛、(E)-2-壬烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、2-十一烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、5-乙基-1-环戊烯基-1-甲醛。其中，3-甲基-2-丁烯醛、2-乙烯基-2-丁烯醛、2-十一烯醛、2,4,6-辛三烯醛属首次在浓香型大曲中检出。

单不饱和醛多具有类似青草、蘑菇味，如(Z)-2-庚烯醛、(E)-2-辛烯醛具有显著的蘑菇味、霉味，可能与包包曲验收过程中所谓的“菌香”有一定关联性。多不饱和醛类(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛，表现为典型的油脂与青草复合香气。

直链饱和醛包括乙醛、己醛、壬醛、癸醛。这4种直链饱和醛在大曲发酵过程和成品中都能检出。乙醛极易挥发，具有刺激性气味。己醛具有显著的青草味，气味阈值为17 μg/L。壬醛和癸醛具有醛香味，气味阈值分别为1 μg/L和6 μg/L。此外，这些直链饱和醛也在浓香型白酒中被全部检出。

支链饱和醛仅有甲硫基丙醛1种。甲硫基丙醛呈现强烈的洋葱味和肉腥味，其仅在大曲发酵的前期过程中发现，成品大曲中没有检出。

图1 不同发酵时期包包曲挥发性成分总离子流图

2.3 酯类（表2）

如表2所示，共检出酯类化合物共40种，其中直链饱和酯最多(21种)，其次为不饱和酯(11种)和支链饱和酯(8种)。

表1 大曲中醛类化合物

9-壬酮酸乙酯、2-羟基-4-甲基戊酸乙酯、甲氧基乙酸异戊酯、12-甲基-十三烷酸甲酯、13-甲基十四烷酸乙酯、15-甲基-棕榈酸乙酯、(E)-2-己烯酸己酯、12,15-辛二烯酸甲酯、(3E)-3-壬烯酸乙酯、肉豆蔻烯酸乙酯、(Z)-9-十五烯酸乙酯、9,12-十六碳二烯酸乙酯、(Z)-9-十七烯酸乙酯等13种酯类在浓香型大曲挥发性物质的研究中首次发现。

表2 大曲中酯类化合物

饱和酯类多呈现水果味，且大部分在浓香型白酒中已经被检出。而不饱和酯类物质对于大曲香味的贡献还不清楚，需以后进一步探讨。

2.4 酮类（表3）

如表3所示，共检出酮类化合物8种，其中饱和酮4种，不饱和酮2种，环酮1种，羟酮1种。

在本次研究中，饱和酮2-辛酮、2-十一烷酮和不饱和酮6-甲基-5-庚烯-2-酮、乙偶姻在浓香型白酒中均有检出。而(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮是首次在浓香型大曲中发现，其呈现辛辣味道，气味阈值为150 μg/L。

2.5 醇类（表4）

如表4所示，共检出15种醇类化合物，其中不饱和醇5种，直链醇3种，支链醇3种，环状醇2种和多元醇2种。

本次研究中有8种醇类物质在中高温大曲中均有检出，且异戊醇、正己醇的含量在醇类中最高[20]。3-甲基-2-丁烯-1-醇具有典型的金属味、酚味，其在发酵前期含量较高，直至发酵结束时逐渐减少，说明其可能是大曲发酵中的一种过程产物[15]。1-辛烯-3-醇具有强烈的蘑菇味和土腥味，阈值为2.7 μg/L。(E)-2-壬烯-1-醇、2,4-己二烯-1-醇分别呈现脂肪味和新鲜蔬菜味，此前在其他浓香型大曲挥发性物质研究中也有检出。

2,3-丁二醇在浓香型白酒和大曲中均有发现，主要呈现黄油和奶油的香气。本次研究定性了2,3-丁二醇的两种异构体([R-(R*,R*)]-2,3-丁二醇、[S-(R*,R*)]-2,3-丁二醇)，而两种异构体对大曲香气的影响还没有相关报道，需进一步探讨。

2.6 芳香族类（表5）

表3 大曲中酮类化合物

表4 大曲中醇类化合物

如表5所示，本次研究共检出22种芳香族化合物，其中芳香酯类5种，芳香醇类4种，芳香醛类3种，酚类4种，萘类2种，烷基苯类2种，噻唑类2种。其中3-苯基-2-丁烯醛、1,5-二甲基萘、2-苯基-1-丁醇、1-甲基-3苯基丙烯醇是首次在浓香型大曲中发现，其他大部分物质在浓香型大曲[3，14，21]和白酒[13，22]中均有检出。

芳香族化合物多数具有花香、甜香味。其中苯乙醇、愈创木酚被认为是优质浓香型大曲的主要香味成分，而苯甲醛、苯甲醇为优质浓香型大曲香味体系的组成部分[24]。酚类物质具有特殊气味，其中苯酚呈现为一种刺激性气味，4-乙基愈创木酚呈现为辛辣味和药味，2-乙烯基愈创木酚呈现为木材味和烟熏味，它们的气味阈值分别为5.5 mg/L、25 μg/L、3 μg/L。

表5 大曲中芳香族类化合物

表6 大曲中吡嗪类化合物

2.7 吡嗪类物质（表6）

如表6所示，本次研究共检出12种吡嗪类化合物,均在浓香型白酒中检出。此次研究中检出的吡嗪类化合物多呈现出坚果味、烘培味、巧克力味，其主要在大曲发酵过程后期(降温期)产生[24]，与高温下的美拉德反应和微生物代谢合成作用有关。2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪被认为是中高温曲中的重要香气物质[21]，气味阈值分别为800 μg/L和200 μg/L。

2.8 呋喃类化合物（表7）

如表7所示，本次研究共检出7种呋喃类化合物。2-戊基呋喃、糠醛、糠醇是重要的呋喃类化合物，在白酒中已经检测到[13]。2-戊基呋喃呈青豆味、金属味，糠醛呈面包味、霉味，糠醇呈水果味，它们的气体阈值分别为6 μg/L、3 mg/L、2 mg/L。有研究表明，2-戊基呋喃、糠醛在发酵的升温阶段是主要的化合物，有很高的浓度[24]。

2.9 萜烯类化合物（表8）

表7 大曲中呋喃类化合物

表8 大曲中萜烯类化合物

表9 大曲中酸类、内酯类化合物

本研究中共检出6种萜烯类化合物（表8），其中α-古云烯、长叶烯、顺-罗汉柏烯、韦得醇这4种化合物是首次在浓香型大曲中发现。α-古云烯在是芒果挥发油的主要成分[25]，且有研究表明含α-古云烯的挥发油有镇静效果[26]。γ-榄香烯在温莪术的挥发油中被分离出来，具有抗癌活性[27]。β-石竹烯呈现木材味、丁香味，在其他大曲挥发性物质的研究中也有发现，具有治疗结肠炎、镇咳等作用[28]。

2.10 酸类、内酯类化合物（表9）

由表9所示，本研究一共发现了3种酸类化合物、3种内酯类化合物。

乙酸呈醋味、酸味，己酸呈汗臭味。γ-丁内酯、γ-己内酯、γ-壬内酯主要呈甜香味、奶香味。这5种化合物均在浓香型白酒中检出。

2.11 其他类化合物（表10）

由表10所示，本次研究中还发现了1种烃类化合物、1种杂环类化合物。其中2-乙酰吡咯具有坚果味，但阈值较高。

表10 大曲中其他类化合物

3 结论

本次研究利用HS-SPME-GC-MS技术从五粮液包包曲中共检测出挥发性化合物137种，其中有26种物质系首次在浓香型大曲中发现。下一步我们将逐步对这些鉴定出来的挥发性物质进行定量，进一步探索五粮液“包包曲”的香气构成及香气活性物质。