赵德义 ，皇甫洁 ，曹建全 ，孙 伟 ，韩兴林 ，王德良

（1.山东景芝酒业股份有限公司，山东潍坊262119； 2.中国食品发酵工业研究院，北京100015；3.科技部国家酒类品质与安全国际联合研究中心，北京100015）

我国白酒酿造具有悠久历史，在工艺上与西方蒸馏酒酿造存在显著不同。我国白酒由于采用多维微生物发酵等传统酿造工艺，酒体和谐丰满，风格独特。与世界上其他蒸馏酒相比，中国白酒是微量风味组分和生物活性成分最为丰富的蒸馏酒。同时，中国白酒香型众多，不同工艺生产的白酒，微量风味组分的含量及比例差异显著。目前国内在研究白酒健康课题时侧重于白酒中单体微量成分，如核苷、四甲基吡嗪、萜烯类等成分。但由于这些成分在酒体中含量较低、研究结果不能准确描述和定量出在以大量酒精为载体溶剂的条件下，这些成分在人体生理代谢中明确的作用。消费者在饮用不同香型或工艺白酒时，普遍反映不同工艺白酒在人体中的积累和代谢速度显著不同，分析认为这可能与其微量成分相关，微量成分比例及种类显著影响酒精在人体内生理代谢的程度。因此，认为不同工艺酿造的白酒，由于其酒体成分含量及比例的差异性，消费者饮酒后的行为情绪感受也有一定差异性。有些白酒造成的不适感相对较少，放松愉悦感相对较明显，有些造成的不适感相对较明显，放松愉悦感相对较小。

消费者饮酒后有不同的感受，包括喜悦、高兴、紧张、舒缓放松、压抑等等。从生物化学角度来说，这些感受是由神经和分子变化机制所调控的。饮酒后体内的酒精及酒体中其他微量成分直接保留或间接转化的小分子代谢物作用于神经元细胞上的受体蛋白，调控其翻译过程，进而增强树突钙离子信号发挥调控作用。饮酒后心情愉悦，自信和健谈，镇静舒缓都与酒和某些酒体成分进入大脑后对奖赏中心的信号激活有关。多年研究已经证明[1，3]，能够参与信号激活的体内小分子代谢物质包括乙醇、乙醛、乙酸、多巴胺、5-羟色胺、5-羟吲哚乙酸、γ-氨基丁酸、肾上腺素等。其中，乙醇、乙醛、乙酸与酒体代谢转化快慢有关，5-羟色胺、γ-氨基丁酸、多巴胺、肾上腺素是神经递质，通过改变其表达水平，影响大脑中的其他化学分子表达，作为化学信使向全身传递信号，控制人的思维过程、行为和情绪。

本实验选定了芝麻香型白酒一品景芝芝香白酒与其他类型的白酒，通过比较分析小鼠灌胃不同白酒30 min和2 h后在固定时间运动的行为参数比，以及小鼠大脑皮层、海马中多巴胺表达水平，基于此从行为整体和分子层面评价以一品景芝芝香白酒为代表的芝麻香型白酒饮用后带来的饮后行为情绪差异。

1 材料与方法

1.1 材料

酒样：来自山东景芝酒业股份有限公司提供的及市售的几款不同品牌芝麻香型及其他类型白酒，分别是：一品景芝芝香白酒（53%vol），一品景芝芝香白酒（42%vol），某芝麻香型酒A（53%vol）、某芝麻香型酒B（42%vol），某酱香型代表酒（53%vol）、某浓香型代表酒（52%vol），伏特加（96%vol）作为食用酒精对照。

实验动物：C57小鼠，雄性，清洁Ⅱ级，4～6周龄，由北京维通利华实验动物有限公司提供。随机选取小鼠80只，平均体重为23 g±2 g，于室温23℃±2℃，光照（150 lx）12 h和黑暗12 h环境，自由饮水进食饲喂，1周后进行实验。实验前提前1天将小鼠置于旷场实验室以适应环境。

1.2 仪器与设备

旷场实验动物行为学跟踪系统：ANY-Maze系统（美国Stoelting公司），该仪器主要由一个半径为20 cm的白底箱壁透明半封闭有机玻璃圆筒组成，其顶部中央悬挂有摄像机，并与记录系统相连，以此来跟踪小鼠在旷场中的行为，其数据由ANYMaze软件进行记录并分析。

柏恩特超纯水制备仪。Multiskan FC酶标仪。

1.3 实验方法

1.3.1 小鼠灌胃

实验时，将小鼠随机分为实验组和对照组1（96%vol食用酒精）和对照组2（生理盐水），每组10只。根据《中国居民膳食指南（2016）》规定：成人饮酒，男性酒精量≤25 g/d，女性≤15 g/d。因此，每只小鼠灌酒酒量按照人体标准饮酒量并依据小鼠单位体重与人体单位体重的药剂等效剂量比值（9.1倍）进行折算。每只小鼠（平均体重20.3 g）灌酒样酒量（将所有酒样统一用蒸馏水稀释至42%vol）为0.15 mL/只；相当于成年男性（平均70 kg）摄入酒精量20.04 g/人。

1.3.2 旷场实验

在灌胃完成后，计录时间。在灌酒后30 min和120 min后，依次按照分组将每只小鼠放置于旷场底面中央。利用高频摄像机及软件跟踪记录动物在旷场内自由运动60 s内的行为变化，采集的数据主要为移动距离。实验过程中保持安静，动作轻柔；每只动物实验结束后，及时清除粪便，使用72%乙醇溶液清洁底面并擦干，减少之前动物的气味，防止行为干扰。

1.3.3 小鼠脑组织样本多巴胺（DA）浓度测定

给小鼠灌胃酒后，分别在30 min和2 h后直接处死小鼠，取材脑组织（大脑皮层、海马体等），液氮保藏后，放于-20℃保存，但应避免反复冻融。将组织标本切割，称取重量，加入一定量的PBS（pH7.4）。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2～8℃的温度。加入一定量的PBS（pH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20 min左右（2000～3000 r/min）。仔细收集上清液。分装后取一份待检，其余冷冻备用。小鼠脑区多巴胺分析采用上海mibio酶联生物公司的小鼠多巴胺（DA）酶联免疫分析(ELISA)试剂盒。

1.4 实验数据统计分析

本实验结果采用SPSS Statistics 24软件，使用单因素ANOVA方法进行统计，并使用Tableau作图，数据使用均数±标准误差表示；同时，使用数值变量对应分析方法和因子分析方法进行分析。

2 结果与讨论

2.1 饮酒后小鼠旷场行为参数差异分析

动物精细行为学是试验动物在精确控制前提下模型解析人在外界环境及刺激下的行为及产生原因的试验系统。在很多场景下不但能模拟人情绪、运动、活动等各方面特点，而且实验结果具有较高的重复性，是目前国际上通行的试验方法。在神经精神药物的评价方面，利用动物行为学方法在神经生物学新机制的发现、神经系统疾病新动物模型的建立、神经系统疾病发病新机制的发现、药物或环境化合物新神经毒性作用及发生新机制的发现等领域得到广泛认可。

本实验将灌胃不同酒样的每组小鼠依次在灌酒前（t0），灌酒后 30 min（t1）和灌酒后 120 min（t2）这3个时刻置于动物精细行为学分析装置旷场中（直径100 cm的白底透明壁的圆柱形设备）中，采用高频摄像机和行为学分析软件分别实时录制与同步分析小鼠在上述3个时刻小鼠自由运动1 min的行为轨迹；通过行为参数自动分析，根据获得的灌酒前和灌酒后的行为学参数，通过灌酒后行为参数（t1，t2）灌酒前行为参数（t0），分析计算得到行为参数比，用于评价和判定小鼠行为受到酒样代谢影响后表现程度，通过分析参数比剔除了组内小鼠生物个体差异影响的偏差。结果见表1。

表1 灌酒后(t1：30 min,t2：120 min)每组小鼠行为参数比(移动距离比)

表1表明：不同白酒的工艺类型、风味微量成分的相互整体作用对酒的饮后行为差异有一定影响。以移动时间比进行说明，在适量饮酒范围内，饮酒后半小时，即使所有的实验酒样都稀释至相同酒精度，但是高酒精度的酒（53%vol）小鼠行为表现兴奋，移动距离比大于1，低酒精度的酒（42%vol）行为表现抑制，移动距离比小于1。这可能与酒体中微量成分的作用有关，高度酒微量成分种类丰富，比例协调，香气口感丰富。在稀释成42%vol后，其微量成分种类和比例虽然也有相应程度上的稀释，但是仍对酒体的整体风格有一定程度影响。53%vol一品景芝芝香白酒与某酱香型代表酒和某浓香型代表酒相比，差异不显著。这两种对照酒样无论是从口味、饮用舒适度和品牌上，长期以来都得到消费者广泛的认可。

根据多年来市场调研数据，多数饮酒环境一般为商业应酬和亲朋聚会，消费者关注的饮酒感受重点在饮酒后30 min内和2 h后，希望饮用后30 min内个人的行为情绪最好能不受酒精的影响，或是感觉适量兴奋或适量放松，有愉悦的感觉，而在饮酒后2 h能够快速恢复到正常，不影响随后的工作和生活。基于前期大量数据积累分析，我们把小鼠酒后行为参数比值范围及人饮酒后感受特征范围进行对比（见表2）。当小鼠饮酒后与饮酒前的比值暨行为参数比值为1，小鼠饮酒后行为恢复正常，对应人饮酒表现为与饮酒前感受相同。当行为参数比值范围区间为1～1.5时，小鼠表现适量兴奋，对应人饮酒表现为精神振奋、愉悦高兴、有活力壮胆；当行为参数比值范围区间为0.5～1时，小鼠表现为适量抑制，对应人饮酒表现为放松舒缓；当行为参数比值范围区间为1.6～2时，小鼠行为表现为过度兴奋，对应人饮酒表现为亢奋、反应过度、行为不受控制；当行为参数比值范围区间为0.2～0.5时，小鼠行为表现为过度抑制，对应人饮酒表现为麻痹，几乎没有反应，行为不受控制；当行为参数比值范围区间为＞2或＜0.2时，小鼠行为表现为失去意识，对应人饮酒表现为失去意识。结果分析表明，53%vol一品景芝芝香白酒饮后30 min，小鼠行为参数比范围在1～1.5之间，表现为适量兴奋，对应的人的感受是精神振奋、愉悦高兴。42%vol一品景芝芝香白酒饮后30 min，小鼠行为参数比范围在0.5～1之间，表现为适量抑制，对应的人的感受是放松、舒缓。饮酒后2 h，53%vol一品景芝芝香和42%vol一品景芝芝香，小鼠行为参数比范围在0.5～1之间，表现为适量抑制，对应的人的感受是放松、舒缓。

若饮酒后和饮酒前行为参数比为1，我们认为酒对行为情绪的影响几乎没有，小鼠行为酒后恢复正常，与饮酒前感受相同，我们把此时酒体行为感受定为标准。为充分比较酒样对行为情绪影响的差异，我们提出了“行为偏离度”这一概念，指饮酒后的行为参数比与1的差值的绝对值。行为偏离度越大，酒样影响效果越大。饮酒后30 min，相同酒精度的某芝麻香型白酒53%vol和42%vol，与一品景芝芝香白酒相比，行为偏离度较大，分别表现为小鼠行为过度兴奋亢奋，对应人的感受是反应过度行为，不受控制以及小鼠行为表现过度抑制麻痹，对应人感受几乎没有反应行为不控制。饮酒后120 min，虽然小鼠行为表现处于适量兴奋或适量抑制范围，但是相同酒精度的某芝麻香型白酒53%vol和42%vol，与一品景芝芝香白酒相比，行为偏离度仍然较大，饮后行为不易恢复。与某酱香型代表酒和某浓香型代表酒相比，行为偏离度差异不显著。

根据以上结果推断，一品景芝芝香白酒酒体中微量成分整体作用会对酒精代谢和饮酒后行为情绪产生一定影响，一品景芝芝香白酒饮用后更易有适量兴奋及适量放松的愉悦感受，更易恢复正常，且酒精的致醉程度较小。

表2 小鼠灌胃后行为参数比值范围及人饮酒后感受特征范围

2.2 饮酒后小鼠脑神经递质多巴胺（DA）表达水平差异分析

多巴胺（C6H3(OH)2-CH2-CH2-NH2），化学名称为4-（2-乙胺基）苯-1,2-二醇，简称（DA），多巴胺是一种神经传导物质，由大脑回报和愉悦中心区域分泌，用来帮助细胞传送脉冲的化学物质，可影响一个人的情绪。2000年，确定多巴胺为脑内信息传递者的研究人员Arvid Carlsson获得了诺贝尔医学奖[1]。多巴胺是大脑的“奖赏中心”，又称多巴胺系统，主要负责大脑的情欲、感觉，将兴奋及开心的信息传递，也与上瘾有关。酒精进入大脑后，在脑的奖赏中心和协同、记忆部位的中心特定部位——伏隔核神经元里发挥作用。酒精引发伏隔核释放出大量的多巴胺，让人们感觉心情愉快，变得自信和健谈，对大脑具有镇静作用[2，4]。酒精在大脑中的神经细胞之间通过受体信号传导激活多巴胺表达[5]。德国埃尔朗根-纽伦堡大学（FAU）的科学家们对13000种食物成分进行了研究，想要找出哪些成分能够刺激大脑反应中心，使人感觉良好，结果发现大麦麦芽和啤酒中含有的大麦芽碱更刺激了多巴胺D2受体，促进了多巴胺释放程度，使人对事物的感觉更喜欢或是具有“上瘾”的偏好性[7]。美国印第安纳大学研究人员发现，啤酒的特殊口味可引发大脑中多巴胺的生成。具有酗酒家族史的人们具有更高的多巴胺指数。这项研究扫描了饮用啤酒和运动饮料佳得乐的49位男性测试者，每位男性测试者每15 min饮用15 mL啤酒，结果表明，饮用啤酒者比饮用佳得乐具有更显著的多巴胺活跃性，同时，测试者在饮用少量啤酒之后表示更渴望饮用啤酒，但这种效应不会出现于运动饮料，虽然运动饮料的口感更佳。这项研究首次令人信服地证实了啤酒口味可在大脑产生特殊刺激效果[8]。多巴胺表达水平在体内处于一种平衡的状态，微量增加引发愉悦自信舒缓喜好，含量降低过多引起运动迟缓、睡眠紊乱压力，含量增加过多引起成瘾嗜好[6]。

表3 小鼠大脑海马体和皮层多巴胺含量

图1 小鼠大脑海马体（左）和大脑皮层（右）多巴胺含量

本实验测定小鼠灌胃后30 min和120 min大脑皮层区和海马区组织中的多巴胺（DA）表达水平，结果见表3和图1。结果表明，不同香型白酒、同香型不同工艺白酒灌胃小鼠后，小鼠大脑皮层以及海马体中多巴胺表达水平差异显著（P＜0.05），多巴胺表达水平在饮用芝麻香型白酒后表达水平显著增加（P＜0.05），可能与芝麻香型白酒酒体中微量成分整体作用和酒精积累程度有关，多巴胺如果表达量增加在一定的适量范围内，可以增加愉悦的情绪感受及对芝麻香型白酒的喜好及认可程度。

3 结论

本实验从行为整体和分子层面测定了小鼠灌胃以一品景芝芝香白酒为代表的芝麻香型白酒及其他类型白酒饮酒后30 min和120 min的旷场运动1 min内的行为参数，以及在此时间点小鼠大脑皮层和海马体中多巴胺表达水平，进一步分析芝麻香型白酒饮后行为情绪及对神经递质水平的影响。研究发现相同类型不同工艺的芝香型白酒，饮后行为情绪表现差异显著，同时多巴胺在大脑中释放程度差异显著，推断可能与白酒中类型和比例的微量成分协同作用相关。芝麻香型白酒相比其他香型白酒，可以引起愉悦放松感觉的神经递质多巴胺在一定程度上适量积累表达，推断可能与酒体中存在的能引起愉悦的风味成分种类及比例相关。