刘瑞莉，吴 磊，袁 玮，柏学进,3，吕娟娟,3，董雅娟,3

(1.青岛农业大学，山东 青岛 266109；2.山东省黑牛繁育工程技术研究中心，山东 青岛 266109；3.山东布莱凯特黑牛科技股份有限公司，山东 淄博 256306)

肌浆球蛋白(Myosin)是骨骼肌中重要的结构蛋白和收缩蛋白，最早由Kuehne发现并命名，其中肌球蛋白轻链3(Myosin light chain 3,MLC1v或MYL3)编码199个氨基酸，位于牛的22号染色体[1]。早期研究发现，MYL3结合Ca2+能够促进肌肉发育，并参与横纹肌的收缩过程[2]，进一步研究发现，MYL3参与肌肉力量发育和神经调节肌肉收缩的相关过程[3]。Meder等[4]研究斑马鱼时发现MYL3的C-末端丝氨酸残基的磷酸化对心脏收缩具有重要意义。近期，人们对MYL3蛋白及其表达的研究主要集中在心肌组织中，发现MYL3主要在哺乳动物的心肌细胞中表达，其突变与心肌肥大有关[5-6]，临床中已将MYL3的突变确定为家族性肥厚型心肌病的病因，并与左心室肥大有关，迄今已确定MYL3中有5个突变：M149V、R154H、E56G、A57G和E143K，均聚集在EF-hand结合区域周围，表明该区域的正确构象对于维持正常的心脏功能是必不可少的[7]。最新研究发现，当人类卫星细胞在缺氧环境中培养时，MYL3基因表达量增加，促进其分化成成肌细胞[8]。因此，推测MYL3基因可能是调节骨骼肌发育的候选基因。

布莱凯特黑牛是青岛农业大学科研成果转化基地及教学实习基地即山东布莱凯特科技股份有限公司培育而成的优良肉牛新种质，2015年我国肉牛权威专家将其鉴定为新种群[9]。鲁西黄牛是一个役肉兼优的地方良种，海外誉为山东膘牛[10]。本试验拟通过对生长性能不同的布莱凯特黑牛和鲁西黄牛的背最长肌和骨骼肌基因进行结构特征分析和功能表达验证，为后续研究肉牛MYL3基因的生物学功能及其表达奠定理论基础，进一步为肉牛肉质性状的分子选育提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验动物选自青岛农业大学科研成果转化基地及教学实习基地即山东布莱凯特黑牛科技股份有限公司。选择饲养条件一致、体况相近、健康的黑牛和黄牛各12头，分别采集黑牛和黄牛2(平均体质量分别为66 kg/54 kg，下同)，6(214 kg/198 kg)，10(273 kg/264 kg)，12月龄(307 kg/291 kg)背最长肌，每个时间点各3头，完成采集后立即放入液氮保存；黑牛宰杀后迅速采集甲状腺、胰腺、肾上腺等组织各2～5 g，立即放入液氮保存。

1.2 主要试剂

TRNzolTrans、DNA MarkerⅡTransSCript ONE STEP gDNA Removal and cDNA SynthesisSuperMix均购自天根生化科技(北京)有限公司；iTaqUniwersal SYBR Green Supermix购自青岛溯源生物有限公司；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(2×)、转印滤纸、TMB显色液均购于上海碧云天生物技术有限公司；抗体：Rabbit Anti-MYL3 antibody、Anti-beta Actin antibody；Anti-Rabbit IgG-FITC、Anti-Rabbit IgG购自北京博奥森生物技术有限公司和美国Sigma公司[11]。

1.3 RNA的提取及cDNA的合成

用TRIzol法从各组织中提取RNA，用全式金反转录试剂盒将提取的RNA反转录为cDNA，具体操作步骤参考文献[11]。

1.4 MYL3基因的克隆与测序及生物信息学分析

根据肉牛MYL3基因(GenBank登录号：NM_001076501.2)序列和GAPDH基因(GenBank登录号：NM_001034034.2)的序列，使用Primer Premier 5.0软件设计引物，引物信息见表1，引物由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成。以上述获得的cDNA为模板进行RT-PCR，对PCR扩增产物进行胶回收，通过T载体连接试剂盒将目的基因连接到pMD19-T载体上，反应体系见表2，具体步骤参照pGM-T克隆试剂盒[11]；转化至DH5α感受态细胞，摇菌，培养12 h后，PCR 检测获得阳性克隆产物，送至上海生工生物有限公司进行测序。

表1 引物信息Tab.1 The primers information

表2 连接反应体系Tab.2 Reaction system of the connection

利用DNAMAN软件进行基因序列比对[11]；采用MEGA 软件构建系统进化树；利用DNAStar中的Protean程序对MYL3蛋白的二级结构进行分析预测；高级结构预测通过在线网站(http://www.expasy.org/seissmod/swiss-mod-el.html)完成。

1.5 MYL3基因的表达分析与统计分析

反应体系(20 μL)：iTaqUniwersal SYBR Green Supermix 10 μL，RNA-free Water 8 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板cDNA 1 μL。反应程序：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，40个循环[11]。统计分析：采用2-ΔΔCT值法计算各样本中MYL3相对内参基因GAPDH的表达量，利用SPSS 17.0软件t检验对数据进行差异显著性分析，结果以平均值±标准差的形式表示[11]。

1.6 荧光免疫组化

组织切片脱蜡、至水后，进行抗原修复，自然冷却至室温；PBS缓冲液清洗3次，8 min/次；滴加山羊血清进行封闭，室温放置30 min；取出玻片，滴加一抗(兔抗山羊MYL3)1∶150，覆盖组织片，置于4 ℃冰箱过夜。PBS缓冲液洗3次，10 min/次，滴加二抗，覆盖组织片，置于37 ℃恒温箱中30 min。PBS缓冲液洗3次，10 min/次；滴加DAPI染色，室温放置5 min；利用抗荧光衰减剂封片，避光保存，荧光显微镜观察并拍照分析[11]。

1.7 总蛋白质的提取及免疫印迹检测

将肌肉组织样品置于预冷的研钵中，用液氮充分研磨，保持低温，将粉末转移到含有1.5 mL RIPA裂解液的离心管中，充分混匀置于冰上30 min，每隔10 min剧烈振荡30 s，加入5× SDS 5 μL，悬浮振荡20 s，3 500 r/min离心1 min。沸水处理5 min，12 000 r/min离心5 min，取上清即肌肉组织总蛋白质。将总蛋白质用SDS-PAGE浓缩分离后转移到PVDF膜上进行蛋白免疫印迹分析，加入抗体稀释比例一抗：Myl3(1∶500)、β-actin(1∶1 000)；二抗辣根过氧化物标记山羊抗兔IgG(H+L)(1∶2 000)，具体步骤参考文献[12]。使用发光试剂盒，在暗室曝光显影。然后扫描底片，利用Image J 1.39U对目的条带进行光密度值分析。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR分析

以布莱凯特黑牛的cDNA 为模板，通过RT-PCR 克隆到一条大约645 bp的条带，经1%琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1，目的条带单一无拖尾，明亮清晰。经测序得到MYL3基因，长度为645 bp，与预期相符，可用于后续试验。

2.2 MYL3生物学信息分析

生物学分析结果表明，MYL3基因CDS序列全长600 bp，编码199个氨基酸；对获得的布莱凯特黑牛MYL3基因CDS序列与牛、瘤牛、野猪、山羊、绵羊、家犬、人、黑猩猩、家鼠和原鸡GenBank中MYL3基因CDS序列进行同源性比较，结果发现(表3)，除家犬(73.65%)和原鸡(71.31%)外，布莱凯特黑牛与其他脊椎动物的同源性均大于80%；采用 UPGMA 法对各物种进行聚类分析(图2)，结果显示，布莱凯特黑牛与牛、瘤牛相距最近，其次与山羊、绵羊相距较近；原鸡与上述动物相距最远。

图1 MYL3基因全长cDNA扩增结果Fig.1 Full length cDNA amplification of MYL3

图2 MYL3 cDNA序列构建的系统发生树Fig.2 Constructed of phylogenetic tree according

2.3 MYL3基因编码蛋白的特征分析

本研究预测分析了布莱凯特黑牛MYL3蛋白的基本性质(表4)，结果发现，该蛋白质的分子式为C969H1529N253O302S11，编码199个氨基酸，其等电点小于5，说明是偏酸性蛋白质；在构成该蛋白质的20种氨基酸中，谷氨酸Glu含量最高(11.6%)，其次是丙氨酸(Ala)和赖氨酸(Lys)(均为10.1%)；不稳定系数和脂溶性指数说明该蛋白质的流动性大；总平均亲水性为-0.606，即水溶性蛋白质。MYL3蛋白的二级结构预测(图3)结果显示，MYL3蛋白以α-螺旋(40%)和无规卷曲(30%)为主，含有少量的β-折叠和β-转角，其中α-螺旋的比例最高；对MYL3蛋白的三级结构进行在线预测，结果如图4所示。

表3 布莱凯特黑牛肌球蛋白轻链cDNA序列与其他物种同源性比对Tab.3 Homology comparison of MYLs cDNA between Black cattle and other species %

表4 MYL3蛋白的基本性质Tab.4 Physiochemical characters of MYL3 protein

图3 MYL3 蛋白二级结构Fig.3 Predicted secondary structure of MYL3 protein

图4 MYL3蛋白的三级结构Fig.4 Predicted tertiary structure of MYL3 protein

2.4 MYL3基因的表达分析

以布莱凯特黑牛为研究对象，选择管家基因GAPDH作为内参对照，分别对10个组织提取的总RNA进行实时荧光定量PCR表达谱分析。由图5可知，MYL3主要在心脏中表达且表达量最高(P<0.01)；其次在背最长肌中表达(P<0.01)；在肝脏、脾脏等其他组织中几乎不表达，彼此之间差异不显著(P>0.05)。研究MYL3基因在不同时期的表达规律发现(图6)，MYL3在4个不同时期随着供试牛月龄的增加基因的表达量逐渐增加，其中鲁西黄牛12月龄的表达量最高，其次是10月龄，基因的表达量均极显著高于6月龄和2月龄2个时期(P<0.01)；6月龄和2月龄MYL3的表达量逐渐降低且差异不显著(P>0.05)。布莱凯特黑牛12月龄的表达量最高且极显著高于其他3个时期(P<0.01)；2，6，10月龄表达量逐渐增加且差异不显著(P>0.05)。同一时期不同品种间MYL3基因的表达量进行比较发现，布莱凯特黑牛均高于鲁西黄牛，其中2，12月龄差异显著(P<0.05)，6，10月龄差异不显著(P>0.05)。

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)；相同字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)。

Values with different small letter mean significant difference(P<0.05);And with different capital letter mean extreme differences(P<0.01);While with the same or no letter mean no significant difference (P>0.05).

图5MYL3不同组织表达水平
Fig.5 The expression level ofMYL3gene in different organization

2.5 荧光免疫组化

如图7，MYL3免疫反应物质为绿色[13]，细胞核呈现淡蓝色或蓝色，在本试验肌肉组织中，MYL3蛋白主要在肌原纤维的粗肌丝中表达，纵切呈条纹状，横切呈边缘状，由此揭示MYL3蛋白可能对肌原纤维起作用，进而对肌肉生长产生影响。

同一肉牛不同月龄间的差异用字母表示。N表示相同月龄不同肉牛间差异极显著(P<0.01)；n表示相同月龄不同肉牛间差异显著(P<0.05)，无字母标注表示差异不显著(P>0.05)。H和B分别代表鲁西黄牛和布莱凯特黑牛。图8同。

The difference between the different ages of the same cattle is indicated by letters. N indicates extreme differences(P<0.01)between different cattle at the same age;n indicates significant difference(P<0.05),no letter mean no significant difference (P>0.05).H and B, respectively, on behalf of the Luxi cattle and Black cattle. The same as Fig.8.

图6MYL3基因不同时期的表达水平
Fig.6 The expression level ofMYL3gene in different periods

图7 鲁西黄牛(A，B)和布莱凯特黑牛(C，D)背最长肌中MYL3蛋白的表达特征Fig.7 Expression of MYL3 protein in the longissimus dorsi muscle of Luxi cattle(A,B) and Black cattle(C,D)

A.不同时期MYL3蛋白的表达量，以β-actin作为内参； B.灰度分析。A.The expression of MYL3 protein in different periods was determined by β-actin as an internal reference; B.Grayscale analysis.

2.6 蛋白免疫印迹

为了进一步研究MYL3基因在蛋白质水平的表达，本试验运用Western Blotting试验验证目的蛋白的表达，得到2条大小约为21 ku的目的蛋白条带：图8-A中MYL3(B)、(H)；得到2条大小约为42 ku的内参蛋白条带：图8-A中β-actin(B)、(H)。结果表明，MYL3蛋白抗体具有良好特异性，且该蛋白在肌肉组织的各时期均有表达，但表达量不同。进一步对蛋白免疫印迹结果进行灰度分析(图8-B)，结果发现，12月龄MYL3蛋白表达量最高，极显著高于其他3个时期(P<0.01)；其次是10月龄和6月龄；2月龄MYL3蛋白的表达量最低，差异不显著(P>0.05)，MYL3蛋白的表达量随着供试牛月龄增加逐渐增加。4个时期黑牛肌肉组织中MYL3蛋白表达量除10月龄，其余3个时期表达量均高于鲁西黄牛，其中2，12月龄表达量差异显著(P<0.05)，6，10月龄差异不显著(P>0.05)。

3 结论与讨论

3.1 肌球蛋白轻链3基因克隆与分析

本研究利用普通PCR法克隆了布莱凯特黑牛的MYL3基因序列，结果显示，MYL3基因CDS序列全长为600 bp，编码199个氨基酸。同源性分析显示，MYL3序列具有较高的同源性，其中布莱凯特黑牛MYL3序列与牛、瘤牛、野猪、山羊、绵羊、人均大于80%，说明该基因CDS序列在脊椎动物中具有高度保守性，与“重要功能蛋白氨基酸置换率较低”理论相一致[14]。生物学信息分析显示，MYL3蛋白分子式为C969H1529N253O302S11，等电点小于5，属于偏酸性蛋白质；不稳定系数大于40，蛋白质结构稳定性较差；蛋白质的总平均亲水性为-0.606，非极性氨基酸含量较高，表现亲水性；二级结构发现，α-螺旋和无规卷曲为主要结构元件，含有少量的β-折叠和β-转角，易于形成球状蛋白，属于all-alpha型，蛋白质的水溶性较好，这与上述预测的蛋白质基本性质中的总平均亲水性相一致。这些特征与其他物种MYL3序列的特征结构均相似[15]。MYL3蛋白三级结构均由一条多肽链构成，结构呈桶状，属于球状蛋白，说明该基因编码蛋白质保守性较强，符合“多基因家族的协同进化”理论[16]，与上述同源性比对中揭示的物种进化关系相一致。

3.2 MYL3基因相对定量表达分析

早期研究发现，肌球蛋白轻链3基因仅在快肌中表达，含有α(MYH6)和β(MYH7)2个不同的亚型，2种亚型的差异表达可以最大限度地调节肌肉的收缩功能[2]。Sherwood等[17]研究发现，MYL3C-末端丝氨酸残基的磷酸化对心脏收缩具有重要意义，综上认为MYL3可能参与肌肉发育和神经调节肌肉收缩的相关过程。本试验研究MYL3基因在不同组织的表达规律时结果发现，MYL3主要在心脏中表达，其次在背最长肌中表达，肝脏、脾脏等其他组织中则几乎不表达，这与在羊上的研究结果一致[8]。Komurcu-Bayrak等[7]使用Northern印迹法研究发现，成年小鼠的MYL3主要在心肌表达，其表达量高于骨骼肌，而在其他组织中则几乎不表达，这与本试验结果相一致。综上研究表明，MYL3基因在骨骼肌中表达水平仅次于心肌，由此推测MYL3可能在肌肉生长发育和肌肉收缩过程中发挥重要的作用。

Koning等[8]研究发现，在低氧环境人的骨骼肌卫星细胞分化时，MYL3基因表达量上调会促进肌源性干细胞转化形成成肌细胞。本试验研究发现，2种肉牛MYL3在4个不同时期肌肉组织中其表达量随着月龄的增加逐渐增加，这与猪上的研究结果一致[18]。MYL3表达量结合肉牛体质量增长曲线发现，MYL3表达量随着月龄增加的同时，肉牛体质量也在增长，顾志良等[19]研究发现，肌球蛋白轻链1(MYL1)在鹅胚胎期肌肉发育过程中起重要作用，MYL1包括MLC1f和MLC1v共2种异构体，在小鼠肌肉的发育阶段，2种异构体的表达是相互独立的，即在发育不同阶段出现，MLC1f是从胚胎骨骼肌的分化时期开始积累，MLC1v从胚胎骨骼肌发育时期开始大量积累[2]。依上述研究结果推测，MYL3基因在骨骼肌的生长发育过程中积累并发挥作用，推测其能够促进骨骼肌的生长发育。同时本试验还发现4个时期黑牛和黄牛肌肉组织中MYL3基因的表达量存在差异，黑牛高于黄牛，这可能与肉牛的品种、个体的饲养环境以及机体的生长发育差异有关，具体关联分析有待进一步研究。

3.3 MYL3蛋白表达分析

采用免疫组织化学的方法研究MYL3蛋白的表达定位，结果发现，MYL3蛋白主要在肌原纤维的粗肌丝中表达，谢遇春[20]研究发现， MYL3 蛋白可能定位于Ⅰ型即氧化性肌纤维上，Wolf Psort预测其亚细胞定位于细胞质的可能性最大，这与本试验MYL3蛋白主要定位于细胞肌浆肌原纤维粗肌丝的结果一致[3]，同时可以印证“肌球蛋白具有ATP的结合位点，构成肌原纤维粗肌丝的主干”这一观点[21]。本试验鲁西黄牛中MYL3蛋白表达的荧光的数量要多于布莱凯特黑牛，说明MYL3蛋白在粗肌丝中发挥作用，不同物种中其表达量不同。

为了进一步研究MYL3蛋白的表达水平，本试验运用Western Blotting试验获得该蛋白质不同时期肌肉组织的相对表达量，结果发现，蛋白在肌肉组织的各时期均有表达且表达量不同。灰度分析发现，2种牛MYL3蛋白在4个不同时期表达趋势相似，均随月龄的增加逐渐增加，其中12月龄MYL3蛋白的表达量最高，极显著高于其他3个时期(P<0.01)；2月龄MYL3蛋白的表达量最低，本研究与上述荧光定量mRNA的表达水平结果相一致，与MYL3表达可能对绵羊骨骼肌的生长没有影响的结果相驳[21]，可能与试验动物种类不同有关，但与猪上的研究结果一致[22]。Lee等[23]在鸡中检测到肌球蛋白基因在胚胎期持续表达，且在肌肉生长发育过程中不同阶段表达的肌球蛋白亚型不同，表明MYL3蛋白在骨骼肌中发挥作用。本试验中供试牛各生长发育时期MYL3蛋白的表达量差异显著，结合肉牛体质量增长曲线分析显示，肉牛体质量增加的同时MYL3蛋白的表达量也增加，Ling 等[24]鉴定了猪MYL1基因mRNA 5 个选择性剪切体(MLC1f、MLC1v、MLC5f-A、MLC5f-B和MLC5f-C)发现，除了剪切体MLC1f外，其余剪切体基因的表达量均随猪个体体质量的增加而逐步增加，到猪成年时其表达量迅速增至最高，与本试验结果一致，因此，推测MYL3基因参与骨骼肌生长发育相关的调节，并在此过程中发挥促进作用。

克隆获得黑牛MYL3基因CDS序列全长，编码199个氨基酸，分析发现其与瘤牛、野猪、山羊亲缘关近，同源性高；不同时期MYL3基因的表达量在肌肉组织中随月龄的增加逐渐增加；MYL3蛋白主要在肌原纤维的粗肌丝中表达，不同生长发育时期蛋白质的表达量随月龄的增加而增加，推测MYL3基因与肌肉生长发育密切相关，可能参与促进肌肉生长发育的相关调节过程。