黄长江 聂婷婷 王迎难 倪吉祥

全球肺癌的病死率占恶性肿瘤病死率第一位[1]。肺癌按组织病理类型分为小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)，NSCLC主要分为鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌，其中NSCLC约占肺癌总数的80%～85%，NSCLC的治疗包括手术、化疗、放疗、靶向治疗等，对有手术适应症手术切除的患者，仍有部分患者复发，化疗对预防其复发具有重要价值[2]。人乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1, BRCA1)的表达与NSCLC化疗疗效及预后密切相关，其表达越低，化疗疗效越好[3]。在肺腺癌细胞中沉默MEIS2基因，BRCA1基因表达降低，提示BRCA1为MEIS2的下游基因[4]。MEIS2基因是同源异型盒基因( homeobox genes, HOX)的分枝基因，人类MEIS2基因位于染色体15q14[5]。MEIS2在个体发育中发挥着重要的作用，缺失后可导致个体发育异常；MEIS2基因在前列腺癌、卵巢癌、神经母细胞瘤等中异常表达，但在肺癌中的研究目前国内外文献报道较少[6-8]。研究MEIS2与BRCA1的关系有利于指导NSCLC接受铂类药物治疗的预后，故研究MEIS2、BRCA1两者表达的相关性及与术后NSCLC化疗预后的关系有重要意义。

对象与方法

一、研究对象

选择2012年2月至 2016年1月在三峡大学人民医院(宜昌市第一人民医院)住院患者61例，所有患者均行手术切除并经病理确诊为NSCLC，收集患者的石蜡包埋组织标本及临床资料，包括性别、年龄、病理类型、分期等。61例NSCLC患者中，>60岁31例，≤60岁30例，男性年龄42～80岁，平均年龄(62±11.1)岁，女性48～70岁，平均年龄(57±9.7)岁；男性43例，女性18例；鳞癌26例，腺癌35例。电话随访患者疾病进展情况，随访起点时间为NSCLC手术后，随访终止时间为2017年1月31日。

二、研究方法

61例NSCLC患者均经手术切除治疗，按美国东部肿瘤协作组PS(performance status，体力状况)评分<2分能耐受化疗，术后接受以铂类为基础的第三代药物联合化疗，化疗方案为：DP方案：多西他赛+顺铂(卡铂或奈达铂)；GP方案：吉西他滨+顺铂(卡铂或奈达铂)；PC方案：培美曲赛+顺铂(卡铂或奈达铂)，共化疗4～6周期。

1. 仪器与试剂： HistoStar组织包埋机、Scientific Shandon石蜡切片机为Thermo Fisher Scientific公司产品，二甲苯、苏木素为上海川翔生物科技有限公司产品，抗原修复液EDTA为上海江莱生物公司产品，MEIS2一抗(SC-81986)、BRCA1一抗(SC-642)均为Santa公司产品。

2. 实验方法： 收集经病理确诊的石蜡包埋组织标本61例，运用免疫组织化学技术检测MEIS2、BRCA1的表达。步骤为：石蜡切片、脱蜡、冲洗，修复液(EDTA)修复，加山羊封闭血清室温下孵育10 min后，加一抗，冲洗，加二抗，37 ℃孵育60 min，冲洗，37 ℃恒温箱中孵育10 min。PBS冲洗，组织切片上加现配DAB试剂，显色5～10 min后置于蒸馏水中终止染色，运用苏木素复染，用蒸馏水冲洗后盐酸酒精分色后蒸馏水冲洗3 min，干燥脱水，中性树胶封片后用显微镜观察。

3. 判断标准： 在显微镜下观察，MEIS2蛋白阳性染色或BRCA1蛋白阳性染色为显微镜下细胞核或浆呈棕黄色沉着，每例切片至少计数10个200倍视野，视野中阳性细胞数<50%者判为低表达，视野中阳性细胞数≥50%者判为高表达。分析MEIS2、BRCA1表达与NSCLC术后化疗疗效两者表达的相关性，按WHO实体瘤标准将疗效分为：完全缓解(complete response, CR)，部分缓解(partial response, PR)，疾病稳定(stable disease, SD)，疾病进展(progression disease, PD)；CR+PR为近期客观有效，有效者应1个月后随访检查确认。无进展生存期(progression free survival, PFS)是从患者开始治疗到肿瘤发生进展或死亡的时间，时间按月计算。

三、统计学方法

结 果

一、免疫组织化学染色结果

MEIS2、BRCA1在NSCLC组织中的表达情况，见图1、2。由图可知，MEIS2在细胞核、浆中呈棕黄色沉着>50%。BRCA1在细胞核、浆中呈棕黄色沉着>50%。

图1 MEIS2在鳞癌及腺癌组织中的高表达(×200)

图2 BRCA1在鳞癌及腺癌组织中的高表达(×200)

二、MEIS2、BRCA1的表达与临床特征的关系

61例患者中，男性43例，MEIS2高表达者为24例，BRCA1高表达者为25例，女性18例，MEIS2高表达者为为11例，BRCA1高表达者为15例，61例患者中从性别、年龄、病理分型、TNM 分期，吸烟等方面进行统计分析，显示MEIS2和BRCA1在NSCLC中的表达与上述临床特征无显著相关性(P>0.05)，见表1。

三、MEIS2、BRCA1的表达与接受铂类药物化疗方案的关系

患者化疗方案、临床特征不一，为避免影响对化疗疗效的判断，将MEIS2、BRCA1高低表达组与患者的化疗方案进行统计分析，显示在化疗方案的选择上无显著性差异(P>0.05)，见表2。

表2 MEIS2、BRCA1的表达与化疗方案

注：DP：多西他赛+顺铂(卡铂或奈达铂)；GP：吉西他滨+顺铂(卡铂或奈达铂)；PC：培美曲赛+顺铂(卡铂或奈达铂)

四、NSCLC中MEIS2和BRCA1的表达相关性

61例患者中MEIS2和BRCA1两者均高表达32例，均低表达18例，MEIS2高表达且BRCA1低表达3例，MEIS2低表达且BRCA1高表达8例，61例NSCLC患者中MEIS2和BRCA1的高表达率分别为57.38%(35/61)和65.57%(40/61)，两者表达呈正相关(r=0.59，P=0.003)。

五、MEIS2、BRCA1表达与化疗疗效关系

对61例NSCLC 患者经至少2周期含铂化疗后进行随访，CR+PR共20例，SD12例，PD29例，MEIS2高表达中CR+PR有7例，5例SD，23例PD，MEIS2低表达中CR+PR有13例，7例SD，6例PD；BRCA1高表达中CR+PR有6例，6例SD，28例PD，BRCA1低表达中CR+PR有14例，6例SD，1例PD，MEIS2、BRCA1表达与化疗疗效有极显著性差异(P<0.01)。

表1 患者临床资料及免疫组化结果

六、MEIS2、BRCA1表达与控制、进展率的关系

61例NSCLC 患者中，MEIS2高表达控制有7例、进展23例，MEIS2低表达中控制有13例，进展6例，两者有显著性差异(P<0.05)。BRCA1高表达控制有6例、进展28例，BRCA1低表达中控制有14例，进展1例，两者有显著性差异(P<0.05)。

七、MEIS2、BRCA1的表达与无进展生存期的关系

61例NSCLC MEIS2高表达患者的无进展生存期为：(31.44±0.41)个月，低表达患者为：(40.5±2.89)个月；BRCA1高表达患者的无进展生存期为：(26.49±0.37)个月，低表达患者为：(44.7±0.66)个月。MEIS2、BRCA1低表达的无进展生存期较高表达组长。Kaplan-Meier生存曲线并统计分析发现MEIS2、BRCA1的表达与无进展生存期有极显著性差异(P<0.01)，见图3～4。

图3 MEIS2基因表达与疾病进展时间的关系P=0.000(月)

图4 BRCA1基因表达与疾病进展时间的关系P=0.000(月)

讨 论

肺癌是全球面临的最严重公共健康问题之一，也是我国最常见的恶性肿瘤之一，2015年我国肺癌新发病例达73.3万，死亡病例达61.0万，死亡率和发病率均居恶性肿瘤的第一位[9]。肺癌可分为SCLC和NSCLC两种病理类型，NSCLC主要分为鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌，85%左右的肺癌患者为NSCLC，近年来年轻肺癌患者且女性肺癌(尤其是肺腺癌)的发病率增加[10]。美国医疗保险数据库统计，初诊肺癌患者有57%已发生远处转移，丧失手术的机会，晚期肺癌一年生存率仅约10%左右，合理运用手术、放化疗及分子靶向治疗等方法，特别是化疗仍然是控制肿瘤进展，延长生存率的重要措施[11-12]。NSCLC的分期采用IASLC(国际肺癌研究协会)第七版2009年或第八版2015年分期标准，对Ⅰa、Ⅰb、Ⅱa和Ⅱb期能耐受手术的NSCLC患者首选手术，部分患者经术前化疗(新辅助化疗)而降低肿瘤分期，再联合手术治疗，可延长患者生存率[13-14]。但在NSCLC患者手术治疗后，术后转移复发率高达80%[15]。化疗可降低其复发率，故化疗是NSCLC的重要治疗措施，术后常使用含铂两药化疗方案治疗4个周期，按美国东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG)对体力状况(performance status, PS)评分≤2分，主要器官能耐受化疗的患者进行化疗[16]。大部分NSCLC患者发现时已处于晚期，失去手术机会，采取多学科综合治疗与个体化治疗相结合的原则，合理应用手术、化疗、放疗和分子靶向治疗等手段，可以最大程度地延长患者的生存时间、控制肿瘤进展和提高患者生活质量[17]。

肺癌的发生与抑癌基因失活和癌基因激活相关，基因表达异常可致相关蛋白功能异常，可促进肿瘤的发生发展[18]。某些基因与肿瘤的预后相关，如文献报道BRCA1基因表达水平与肿瘤接受铂类药物化疗的敏感性相关[19]。我们运用短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)干扰技术介导肺腺癌A549细胞的MEIS2基因沉默，shRNA介导的MEIS2基因沉默可诱导A549出现生长抑制、密度稀疏、细胞皱缩、流式细胞检测提示细胞凋亡，G2/M期比例增高，基因芯片检测DAVID分析发现DNA复制及细胞周期信号通路基因表达全面下调，BRCA1表达下调明显，实验验证BRCA1 mRNA水平和BRCA1蛋白表达水平降低，MEIS2沉默后BRCA1表达也降低，显示MEIS2在NSCLC细胞的调控中，BRCA1是其下游基因，MEIS2通过BRCA1调控NSCLCA549细胞生长及细胞周期阻滞[4]。MEIS2基因与肺癌的发生发展相关，是否也与接受含铂药物的化疗敏感性相关，本文通过收集病例进行了探讨。

人乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1, BRCA1)是首先被发现的具有遗传倾向乳腺癌易感基因[20]。研究发现，铂类药物作用机制为在细胞核内与DNA结合，通过DNA链内、链间交联，使DNA双链、单链断裂和损伤，抑制细胞分裂，杀灭肿瘤细胞而起治疗作用[21]。BRCA1在铂类药物导致的DNA损伤中具有修复能力，故使铂类药物存在耐药性，BRCA1高表达时提高了细胞修复DNA损伤的能力，导致铂类药物耐药[22]。除了与DNA损伤药物的关系外，BRCA1还具有调控有丝分裂的作用，BRCA1基因参与有丝分裂纺锤体的形成及染色体的正确分离过程，与紫杉类药物(纺锤体毒性药物)化疗敏感性相关[23]。同时在肿瘤生长和转移相关的血管生成过程中BRCA1也发挥了一定作用。BRCA1的表达与NSCLC化疗疗效及预后密切相关，其表达越低，化疗疗效越好，生存越长，反之生存越差[24]。

在生物发育中，其某一部位的性状特征出现在其他部位的现象，称为同源异形突变[25]。在研究果蝇胚胎发育过程中，发现果蝇的形态发育由一套基因编码的蛋白质决定，若其中某基因发生突变，就会出现同源异形突变，所以称这套基因为HOX基因(即同源盒基因或同源异型盒基因)[26]。同源盒基因分为2类，Ⅰ类为HOX基因，Ⅱ类为HOX分枝基因，包括TALE家族(含MEIS家族及PBX家族)、PAX等，人类MEIS基因家族成员包括：MEIS1、MEIS2、MEIS3[5]。MEIS2通常与PBX形成蛋白复合物，进而与HOX基因相互作用通过信号通路促进下游基因的转录并参与个体发育以及分化过程，MEIS2在个体发育中发挥着重要的作用[27]；MEIS2在斑马鱼中表达下调，其心脏发育则出现严重受损[28]；MEIS2与PAX3、PAX7相互作用调控顶盖发育，在脑的发育中起重要作用[29]；MEIS2通过促进PAX6及cyclin D1在眼的及视网膜的发育中起重要作用[30]。MEIS2基因在肿瘤中常异常表达，提示MEIS2基因与肿瘤的发生发展密切相关，James等[6]报道MEIS2基因表达与前列腺癌的复发、转移有关。Crijns等[7]报道MEIS2基因在卵巢癌中广泛表达，并且可能在卵巢中起致癌作用，MEIS2基因在卵巢癌细胞株A2780中可降低对顺铂的药物敏感性。MEIS2基因表达与卵巢癌的总生存率相关，MEIS2基因涉及卵巢致癌过程，可能在DNA结合，细胞周期控制，血管生成和细胞-细胞间信号传递等过程中起作用。

对本组61例NSCLC患者测定肺癌组织中MEIS2基因的表达情况发现，MEIS2的表达与性别、年龄、病理类型、临床分期、吸烟状况均无明显差异性，但MEIS2和BRCA1两者的高低表达存在显著相关性。统计分析显示MEIS2、BRCA1与NSCLC患者术后接受铂类药物化疗的预后相关，MEIS2和BRCA1的表达越低，化疗疗效越好。但本文纳入的样本数量有限，尚需更多研究以进一步证实MEIS2与NSCLC患者接受铂类药物化疗敏感性的关系，同时需进一步研究MEIS2与铂类药物敏感性的机制，以指导NSCLC的治疗。