冉玉梅，李竹青，丁寅翼，赵 琪，施用晖，2，乐国伟*，2

（1.江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122；2.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡 214122）

食品中的蛋白质在加工、储存及运输过程中，不可避免的会受到高温、挤压、剪切力等物化因素的作用，或者在自由基和脂质过氧化物的存在下发生氧化修饰[1-2]。蛋白质氧化修饰不仅降低食品的感官品质和营养价值，其氧化产物可能危害人体健康。在肉制品和奶制品的加工过程中都会发生蛋白质氧化修饰[3-4]。动物实验表明，摄入氧化蛋白质会导致小鼠血液和组织中自由基水平显著升高，丙二醛含量显著增加，抗氧化酶活性下降[5]。

酪氨酸广泛存在于蛋白质含量丰富的食品中，在加工过程中，容易被氧化修饰成双酪氨酸和3-硝基酪氨酸，双酪氨酸与多种神经退行性疾病密切相关，双酪氨酸会促进β-淀粉样蛋白的形成和核突触蛋白聚集，它们分别是阿尔茨海默病脑部老年斑和帕金森患者路易小体的主要成分，具有神经毒性[6-7]。3-硝基酪氨酸也具有神经毒性，会损伤多巴胺神经元，造成神经功能障碍[8]。

前期研究表明氧化酪蛋白和酪氨酸氧化产物会造成动物机体组织出现氧化损伤[9-10]。食入酪氨酸氧化产物是否会在脑组织中积累尚不清楚。本文作者在探讨食源性酪氨酸氧化产物对大鼠脑部氧化还原状态及空间学习记忆的影响。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

酪氨酸氧化产物 （TOP，tyrosine oxidation products）：实验室自制[10]；Trizol裂解液：美国Biomiga公司；荧光染料SBY：南京诺唯赞生物科技有限公司；M-MLV逆转录酶：美国Promega公司；DEPC、基因引物：上海捷瑞生物工程有限公司。3-硝基酪氨酸（3-NT）、双酪氨酸（Dityr）和 β-淀粉样蛋白（Aβ40）试剂盒：厦门慧嘉生物科技有限公司；丙二醛（MDA）和4-羟基壬烯醛（4-HNE）试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 实验仪器

ANY-maze动物行为学视频分析系统：美国Stoeling公司；动物行为学实验装置：上海欣软信息科技有限公司；7900HT Fast实时荧光定量PCR系统：美国ABI公司；5804R高速冷冻离心机：德国Effendorf公司；超低温冷冻冰箱：美国INVETRO公司；One drop：上海天美科学仪器有限公司；PCR基因扩增仪：美国MJ公司。

1.3 动物实验

4周龄清洁级雄性SD大鼠40只，随机分成4组：Control组（正常日粮，n=10） 、Tyr组（添加 0.44%酪氨酸，n=10）、TOP1组（添加0.22%酪氨酸氧化产物，n=10）、TOP2组 （添加0.44%酪氨酸氧化产物，n=10）。饲养环境：温度为23±2℃，湿度为60%，采用12/12 h循环光照。饲养期间大鼠可自由采食和饮水。饲喂24周后进行Morris水迷宫实验。

1.4 实验方法

1.4.1 Morris水迷宫实验Morris水迷宫（Morris water maze）是1981年由Richard G.Morris建立，主要用于测试动物海马依赖性空间学习与记忆能力。实验强迫动物游泳并学会寻找隐藏在水中的平台，以测试实验动物对空间位置觉和方向觉的学习与记忆能力[11]。

水迷宫装置是一个圆形塑料游泳池，直径180 cm。如图1所示。水温保持在25±0.5℃。游泳池分为 4个象限，分别标记为 North，South，East和West。实验中所用的逃生平台直径为12 cm。整个实验过程中，保持环境安静，房间内物件摆放要给动物提供空间线索。

经典的Morris水迷宫分为定位航行实验（Place Navigation）和空间探索实验（Probe Trial）两部分。

1）定位航行实验。定位航行实验是将平台没于水面下1 cm，并用白色无毒染料将水染成白色不透明状，保证不能从水面直接看到隐藏在水下的平台。该实验用于训练大鼠学会寻找隐藏在水面下的平台。定位航行实验历时4 d，训练时由实验者将大鼠面向池壁轻轻地放入水池中让其自由游泳。每只大鼠每天训练4次（分别从4个象限放入水中），每次时间间隔不得少于30 min。记录大鼠寻找到隐藏在水面下平台的时间，即逃避潜伏期（Escape latency），并让其在平台上熟悉记忆周围环境15 s。最大游泳时间限度为60 s，若大鼠在60 s内未能找到平台，由实验者引导大鼠爬上平台并让其熟悉记忆周围环境20 s。实验结束后，用干净的毛巾将大鼠擦干并让其待在温暖的地方。

2）空间探索实验。定位航行实验结束后，撤出平台，让大鼠自由探索60 s。记录其在60 s内在各个象限中的停留时间，以及穿越原平台所在象限的次数及在该象限中的游泳路程。该实验用于检测大鼠学会寻找平台后，对平台空间位置的记忆能力。

图1 Morris水迷宫装置示意图Fig.1 Diagram of Morris water maze

1.4.2 组织取样和处理行为学结束后，处死大鼠，解剖取海马组织。其中一半的海马组织用生理盐水按重量体积比为1∶10制成组织匀浆液，4℃，4 000 r/min离心10 min，取上清，-80℃保存。另一半海马组织按50 mg组织加入1 mL Trizol的比例加入Trizol溶液，匀浆，-80℃保存，用于提取RNA。

1.4.3 海马组织各生化指标的测定Dityr、3-NT、Aβ40、MDA、4-HNE均严格按照说明书操作，蛋白含量以牛血清蛋白为标准品，采用Bradford法测定[12]。

1.4.4 实时荧光定量PCR分析采用Trizol法提取海马组织中总的RNA，用One drop测定RNA的260 nm/280 nm吸光度比值 （1.8～2.0表示纯度符合要求）。逆转录成cDNA，以β-actin为内参，用实时荧光定量PCR检测目的基因的Ct值，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Sequences of the primers

1.5 数据统计与分析

实验数据用Graphpad Prism 5.0软件进行统计分析和图形绘制。结果以平均值±标准差（x±s）表示。运用单/双因素方差分析 （ANOVA），Turkey检验进行组间比较，显著性水平为p＜0.05。

2 实验结果

2.1 酪氨酸氧化产物对大鼠Morris水迷宫空间学习记忆的影响

Morris水迷宫实验用于检测大鼠的空间学习记忆能力。李竹青等人研究发现长期摄食氧化酪蛋白会诱导机体组织产生氧化应激[9]。长期慢性的氧化应激会损伤脑部，尤其是海马等敏感部位，从而影响动物的学习记忆[13]。

由图1（a）可知，在定位航行实验中，各组大鼠第1天的逃避潜伏期没有显著差异（p＞0.05），但是TOP1组（44.08±6.70）s和 TOP2组（46.86±7.15）s高于 Control组（41.40 ± 7.24）s。Control组、Tyr组和TOP2组大鼠从第2天开始，逃避潜伏期显著低于第1天（p＜0.05），TOP1组从第3天开始潜伏期显著低于第1天（p＜0.05）。第3天各组大鼠的逃避潜伏期都显著低于第p天（p＜0.05），组间没有显著性差异 （p＜0.05），TOP1 组 （18.28 ± 3.16） s、TOP2 组（19.57±4.56）s高于 Control组（14.00±3.96）s和Tyr组（15.56±4.15）s。各组大鼠第4天的逃避潜伏期与第3天相比都没有显著性差异（p＞0.05），但是和第3天呈现相同的趋势，TOP1组 （16.06±2.62）s、TOP2组 （17.44 ± 3.18）s高于 Control组（12.56± 2.12）s和 Tyr组（10.24± 2.89）s。 总体来看，经过4 d的训练，各组大鼠潜伏期都随着时间的延长显著下降（p＜0.05）。从第1天到第3天，下降明显，从3天到第4天，下降趋势减缓。各组大鼠呈现相似的学习曲线，最终都能够学会寻找逃生平台，但是酪氨酸氧化产物组大鼠潜伏期略高于正常组大鼠，表明酪氨酸氧化产物可能在一定程度上损伤了其空间学习能力。

由图1（b）可知，空间探索实验中，在原平台象限的停留时间，TOP1组和TOP2组显著低于Control组和 Tyr组（p＜0.05）。 Tyr组与 Control组、TOP1 组和TOP2组之间都没有显著性差异（p＞0.05）。如图1（c）所示，统计大鼠在原平台象限的游泳路程，TOP1组、TOP2 组显著低于 Control组 m（p＜0.05），但是与Tyr组相比没有显著性差异 （p＞0.05）。Tyr组与Control组之间、TOP1组与TOP2组之间都没有显著性差异（p＞0.05）。 由图 1（d）可知，各组大鼠进入原平台象限的次数呈现与停留时间相同的趋势。结果显示TOP1组和TOP2组大鼠不能准确定位原平台所在位置，表明酪氨酸氧化产物损害了大鼠的空间记忆能力。

2.2 酪氨酸氧化产物对大鼠海马组织中氧化产物的影响

Dityr和3-NT是蛋白质中酪氨酸残基氧化修饰的产物，它们能特异性的反映蛋白质氧化程度[14]。Aβ的含量与Dityr相关。Dityr在Cu2+的作用下可以促进Aβ的形成，而Aβ是阿尔茨海默病患者老年斑块的主要成分，具有神经毒性[15]。由图2可知，饲喂酪氨酸氧化产物24周后，TOP1组和TOP2组大鼠海马组织中蛋白质氧化产物Dityr、3-NT含量显著高于 Control组和 Tyr组（p＜0.05），并呈现剂量效应。同时，TOP1组和TOP2组Aβ40含量也显著高于 Control组和 Tyr组（p＜0.05）。

MDA和4-HNE是两个强毒力的脂质过氧化产物，是判断机体脂质过氧化的常用指标[16]。在组织中积累不仅会直接造成细胞损伤，还会通过与蛋白质、酶等发生交联反应造成蛋白质结构和功能的改变，从而进一步影响组织正常生理功能。由图3可知，酪氨酸氧化产物导致大鼠海马组织中脂质过氧化产物明显积累。TOP1组和TOP2组的MDA、4-HNE含量都显著高于Control组和Tyr组（p＜0.05），酪氨酸氧化产物对4-HNE含量的影响呈现剂量效应。

综上，长期摄入酪氨酸氧化产物导致大鼠海马组织氧化还原状态失衡，蛋白质和脂质氧化产物积累，氧化产物的积累会损伤大鼠海马组织细胞功能，从而导致其海马依赖性空间学习记忆障碍。

图2 酪氨酸氧化产物对大鼠海马组织中蛋白质氧化产物的影响（±s，n=10）Fig.2 Effects of tyrosine oxidation products on oxidative protein in rat hippocampus

图3 酪氨酸氧化产物对大鼠海马组织中脂质氧化产物的影响（±s，n=10）Fig.3 Effects of tyrosine oxidation products on lipid peroxides in rat hippocampus

2.3 酪氨酸氧化产物对大鼠海马组织抗氧化和炎症相关基因的影响

由图4可知，TOP1组和TOP2组大鼠海马组织中Nrf2的表达较Control组和Tyr组显著上调 （p＜0.05）；TOP2组Nrf2的表达较TOP1组也显著上调（p＜0.05）。Nrf2是细胞氧化应激反应中的关键因子。正常生理条件下，Nrf2与Keap1结合存在于细胞核内。当机体发生氧化应激时，Nrf2从Keap1上解离下来并与抗氧化反应元件ARE结合，调节抗氧化蛋白和II相解毒酶等的表达。Nrf2-ARE是体内抗氧化重要的通路，该通路的激活能够保护神经细胞免受氧化应激损伤[17]。

图4 酪氨酸氧化产物对大鼠海马组织抗氧化和炎症相关基因表达的影响（±s，n=10）Fig.4 Effcets of tyrosine oxidation products on expression of antioxidation and inflammation related genes in hippocmapus

此外，TOP1组和TOP2组海马组织中 NF-κB的表达较 Control组和 Tyr组显著上调（p＜0.05）；同时TOP2组的NF-κB表达较TOP1组也显著上调（p＜0.05）。此外，TOP1组和 TOP2组的 iNOS表达也显著高于 Control组和 Tyr组（p＜0.05），但 TOP1 组和TOP2组之间没有显著性差异（p＞0.05）。氧化应激除了启动Nrf2防御机制外，还会激活NF-κB，活化的NF-κB能够诱导促炎因子iNOS的过量表达，iNOS可以持续催化产生大量的一氧化氮 （NO），过量的NO不仅会造成蛋白质硝基化，还会导致神经细胞凋亡[18]，从而造成大鼠空间学习记忆障碍。

2.4 海马组织基因表达与相应氧化损伤指标的相关性分析

相关性分析显示，MDA 与 Nrf2（r=0.796，p＜0.05）、NF-κB（r=0.884，p＜0.05）、iNOS（r=0.763，p＜0.05）成显著正相关；HNE 与 Nrf2（r=0.709，p＜0.05）、NF-κB（r=0.862，p＜0.05）、iNOS（r=0.711，p＜0.05）成显著正相关；Dityr与 Nrf2（r=0.854，p＜0.05）、NF-κB（r=0.878，p＜0.05）、iNOS（r=0.764，p＜0.05）成显著正相关；3-NT 与 Nrf2（r=0.843，p＜0.05）、NF-κB（r=0.857，p＜0.05）、iNOS（r=0.764，p＜0.05）成显著正相关；同时Aβ40 与 Dityr（r=0.694，p＜0.05）也呈现正相关。

3 讨论

酪氨酸广泛存在于富含蛋白质的食品中，其酚羟基极易受到氧化，造成酪氨酸氧化产物在食品中积累，长期食入酪氨酸氧化产物会诱导机体组织出现氧化应激，氧化产物在组织细胞中积累。氧化应激会造成机体内蛋白质和酶等氧化修饰，蛋白质氨基酸氧化修饰不仅影响组织细胞正常生理功能，还会产生很多有害物质，例如色氨酸氧化形成的犬尿氨酸具有神经毒性，会损伤小鼠新物体识别记忆并增加其焦虑情绪。而酪氨酸氧化生成双酪氨酸和3-硝基酪氨酸。3-硝基酪氨酸会造成神经元丢失，损伤多巴胺神经系统，它们都与阿尔茨海默病、帕金森病等多种神经退行性疾病相关。前期研究表明，长期摄食氧化酪蛋白会造成小鼠机体组织氧化应激和学习记忆能力下降。长期摄入酪氨酸氧化产物（包括双酪氨酸和3-硝基酪氨酸等）会造成大鼠肝肾和心肌组织出现氧化损伤。食入酪氨酸氧化产物是否会在脑组织中积累并影响脑部功能，尚不清楚。本文通过长期饲喂实验，初步探讨了酪氨酸氧化产物对大鼠空间学习记忆及海马组织的影响。

酪氨酸氧化产物饲喂24周后，大鼠在Morris水迷宫空间的定位航行实验阶段，寻找隐藏平台的时间比正常组和Tyr组大鼠都要长，表明其空间学习能力可能受到一定程度的损伤。在空间探索实验阶段，酪氨酸氧化产物组的大鼠穿越原平台所在象限的次数及其在该象限的停留时间均显著低于正常组大鼠，表明酪氨酸氧化产物损害了大鼠的空间记忆能力。同时酪氨酸氧化产物组大鼠海马组织中脂质过氧化产物及蛋白质氧化产物均出现明显积累，MDA、4-HNE、Dityr、3-NT、Aβ40 的含量均显著高于Control组，表明酪氨酸氧化产物诱导大鼠海马组织出现氧化应激。由此推测酪氨酸氧化产物诱导海马组织氧化应激，造成氧化产物的积累可能是造成大鼠学习与记忆能力减退的重要原因。本文进一步检测了抗氧化关键基因和炎症相关基因的mRNA表达水平。结果显示，酪氨酸氧化产物组大鼠海马组织中 Nrf2、NF-κB和 iNOS的表达较Control组都显著上调。Nrf2是细胞氧化应激反应中的关键因子，Nrf2的激活可以调控下游抗氧化基因和蛋白的表达，从而启动机体防御机制以保护细胞免受氧化应激的损伤。氧化应激激活Nrf2的同时也激活了NF-κB，活化的NF-κB进一步激活下游炎症相关基因iNOS的表达，从而诱导细胞损伤或凋亡。酪氨酸氧化产物组大鼠出现空间学习记忆障碍表明机体自身的防御机制不足以抵抗酪氨酸氧化产物导致的氧化损伤。

4 结语

酪氨酸氧化产物的长期暴露诱导大鼠海马组织氧化应激、氧化产物在海马组织中积累，导致大鼠出现空间学习与记忆能力障碍。本文只是初步探讨了酪氨酸氧化产物对大鼠空间学习记忆的影响，但其具体的损伤机制还有待进一步研究。总之，食品中蛋白质氨基酸的氧化修饰及其产物对人体健康的影响需要受到更多的关注，本文为改进蛋白质食品加工条件提供了一定的理论依据，对人们健康饮食具有一定的指导意义。