董森林,吴 丹,王艳青

(山西医科大学第二医院皮肤科,太原 030001;*通讯作者,E-mail:shuxin0352@126.com)

为了延缓淋球菌对头孢曲松的耐药,2012年美国及欧洲一些国家开始推荐头孢曲松联合阿奇霉素作为治疗淋病的一线方案[1,2]。近年来,一些指南也提出把庆大霉素联合阿奇霉素作为一种替代方案[3],用于不适合使用头孢曲松的人群。庆大霉素在我国已很少使用,为了了解庆大霉素联合阿奇霉素体外抗淋球菌的特点,以我院皮肤性病门诊收集的27株淋球菌为研究对象进行研究,了解庆大霉素联合阿奇霉素体外抗淋球菌的特点。

1 材料与方法

1.1 标本采集

研究对象为2017-08～2018-01山西医科大学第二医院皮肤性病门诊就诊的淋病患者,临床表现尿频、尿急、尿痛,脓性分泌物。用无菌试子采集分泌物后接种至巧克力琼脂板,于36 ℃的CO2培养箱中培养24-48 h,分泌物培养阳性的共有27例,其中26例为男性患者,1株为女性患者,年龄分布为21-52岁,平均年龄36.0岁。通过革兰染色、氧化酶实验、糖发酵实验鉴定后传代1次,洗脱于脱脂牛奶中,置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 主要试剂

GC琼脂粉来自北京兰博利德商贸有限公司,脱脂牛奶来自英国OXOID公司,革兰染液来自珠海贝索生物技术有限公司,庆大霉素来自北京索莱宝科技有限公司,阿奇霉素来自北京泰泽嘉业科技发展有限公司,无菌脱纤维新鲜羊血来自北京瑞茂宏达科技有限公司。配制抗生素培养基时需用GC琼脂粉及10%的无菌脱纤维新鲜羊血。

1.3 抗生素敏感性检测

1.3.1 琼脂稀释法[4]测定庆大霉素、阿奇霉素单独作用的MIC 培养皿中抗生素的浓度范围:庆大霉素1.00-32.00 mg/L,阿奇霉素0.03-1.00 mg/L,将分离纯化后的淋球菌配成107cfu/ml的菌悬液,用多头接种仪接种至含有抗生素的琼脂培养皿上,置于36 ℃含有5%浓度CO2的培养箱中,24 h后观察结果,以没有淋球菌生长的最低药物浓度为MIC。

1.3.2 琼脂棋盘稀释法测定联合用药MIC ①根据单独用药抗淋球菌得到的最小抑菌浓度(MIC)采用倍比稀释法制备抗生素工作液,即2×MIC、1×MIC、0.5×MIC、0.25×MIC、0.125×MIC、0.06×MIC浓度的庆大霉素工作液及2×MIC、1×MIC、0.5×MIC、0.25×MIC、0.125×MIC、0.062×MIC浓度的阿奇霉素工作液。②联合用药工作液制备:在96孔板上采用棋盘法制备庆大霉素工作液与阿奇霉素联合作用工作液。③含有抗生素的琼脂培养皿制备:96孔板中每个含有药液的孔对应1个培养皿,标记好后制备庆大霉素和阿奇霉素联合用药琼脂培养皿。④将分离纯化后的淋球菌配成107cfu/ml的菌悬液,用多头接种仪接种至含有抗生素的琼脂培养皿上,置于36 ℃含有5%浓度CO2的培养箱中,24 h后观察结果。⑤以淋球菌不能生长的最低浓度为MIC,获得联合用药时MIC庆大(联合)、MIC阿奇(联合)。⑥计算部分抑菌浓度指数FICI:FICI=MIC庆大(联合)/MIC庆大(单独)+MIC阿奇(联合)/MIC阿奇(单独)。

1.3.3 结果判定 ①根据文献[5,6]的研究,庆大霉素MIC≥32 mg/L为耐药,8-16 mg/L为中度敏感,≤4 mg/L为敏感;参照欧洲抗菌药物敏感性检测委员会(EUCAST)标准[7],阿奇霉素MIC≥1 mg/L为耐药,=0.5 mg/L为中度敏感,≤0.25 mg/L为敏感。②FICI≤0.5表现为协同作用,0.54表现为拮抗作用[8,9]。

2 结果

2.1 淋球菌对庆大霉素、阿奇霉素的敏感性

庆大霉素的MIC均值为4.444 mg/L,范围为4.000-8.000 mg/L,27株淋球菌临床株中88.9%(24/27)对庆大霉素表现敏感,11.1%(3/27)的菌株对庆大霉素中度敏感,未检测到对庆大霉素耐药的菌株(见表1)。阿奇霉素的MIC均值为0.147 mg/L,范围为0.060-0.500 mg/L,92.5%(25/27)的淋球菌对阿奇霉素表现敏感,7.5%(2/27)的淋球菌对阿奇霉素中度敏感,未检测到对阿奇霉素耐药的菌株(见表1)。

表1 淋球菌对庆大霉素、阿奇霉素的敏感性结果

2.2 庆大霉素与阿奇霉素体外抗淋球菌的联合作用

联合用药时FICI均值为2.35,FICI范围为0.75-4.00,实验中庆大霉素与阿奇霉素联合使用在体外抗淋球菌均表现为相加作用,未发现协同作用,也无拮抗作用(见表2)。

表2 27株淋球菌部分抑菌浓度指数结果

3 讨论

在马拉维等国家,庆大霉素被认为在治疗淋病方面既经济又高效,并且在临床上有95%的治愈率[5]。国外的一项Meta分析发现,庆大霉素治疗淋病的有效率达91.5%[5],另外,关于庆大霉素疗效及安全性的Ⅲ期临床试验也在进行[5]。可见,在选择治疗淋病的替代药物时,一些研究者开始关注庆大霉素在治疗淋病方面的特点。在我们的实验中,发现88.9%(24/27)的淋球菌对庆大霉素敏感,还有11.1%(3/27)的淋球菌对庆大霉素表现出中度敏感,未发现对庆大霉素耐药的菌株。

近年来,研究发现淋球菌对阿奇霉素的耐药逐渐增加[10,11],但是我们的实验中未发现对阿奇霉素耐药的菌株,可能因为不同地区淋球菌对抗生素的敏感性会不同,另外,我们实验的样本较小对实验结果也会有影响。我们还需要继续监测淋球菌对阿奇霉素的敏感性并进行进一步的研究。

与Singh等[12]的结果相同,淋球菌对庆大霉素比较敏感,当庆大霉素与阿奇霉素联合时,主要表现为相加作用,没有发现拮抗作用、协同作用的出现。由于庆大霉素的耳毒性及肾毒性作用,限制了其在抗菌方面的应用。但是庆大霉素的毒性作用多与血药浓度超过毒性阈值的持续时间有关[13],而目前庆大霉素在治疗淋病时多采用240 mg肌肉注射。一些研究发现,庆大霉素联合阿奇霉素最常见的副作用是腹胀等消化道症状[14]。为了更详细地了解庆大霉素联合阿奇霉素在抗淋球菌方面的作用,还需要进行动物体内实验等研究。当然,加强淋球菌的耐药监测,并控制耐药淋球菌的传播也十分重要。