罗孝美， 李 硕， 黄丽欣， 彭波辉， 彭 昌△

(遵义医科大学 1基础医学院生理教研室， 2附属医院儿内科， 贵州 遵义 563000)

心脏发育是个极其复杂的过程，受到众多因素的调控[1-4]。任何微小的变化均会导致心脏发育异常引起先天性心脏病[5]。研究证实，孕期饮酒可以导致胎儿酒精综合征，该综合征中最严重的畸形之一就是心脏发育畸形[6-7]。先天性心脏病给家庭及社会均带来了严重的经济及社会负担。因此，深入探讨孕期饮酒致心脏发育畸形的研究将为先心病的防治提供重要的理论依据及干预靶点。研究表明，组蛋白甲基化修饰在心脏发育过程中发挥了重要的调控作用;组蛋白甲基化包括组蛋白一甲基化、二甲基化及三甲基化;组蛋白包括4种亚型，与心脏发育关系较为密切且研究较多的是组蛋白H3;而组蛋白H3的甲基化位点主要包括H3K4、H3K9、H3K27和H3K36等;在心脏发育过程中甲基化修饰的主要作用是调控心脏核心转录因子的转录活性，开启或沉默心脏发育相关下游基因的表达[8-11]。因此，本研究通过孕期酒精暴露小鼠来探讨组蛋白甲基化修饰状态，为进一步明确酒精暴露致子代心脏发育异常的表观遗传机制提供参考资料。

材 料 和 方 法

1 实验动物及分组

选取健康雌性成熟SPF级、周龄为14周的昆明小鼠36只，体重25～30 g，购自于重庆医科大学，动物许可证号：SYXK(渝)2012-0015。按雌∶雄=2∶1合笼，次晨以观察到阴栓的雌鼠而将其胎鼠的胎龄(embryo, E)记为0.5 d(E0.5)。将孕鼠按照随机数字表法随机分为4组：正常组、空白对照组、酒精组和酒精+抑制剂组,每组6只孕鼠。参照文献及本课题组前期研究[12-13]，于E0.5给予56%乙醇(5 mL·kg-1·d-1)灌胃，每日1次直至E14.5，同时给予组蛋白甲基转移酶(histone methyltransferase，HMT)亚型G9a特异性抑制剂BRD4770 (1 mg·kg-1·d-1)灌胃，每日1次直至E14.5，空白对照组予等量生理盐水灌胃。

2 小鼠心脏标本制备

参照文献及本课题组前期研究[12-13]，于酒精灌胃结束后选取E14.5和E16.5孕鼠,二氧化碳麻醉处死，剖开腹腔找到串珠样子宫取出胚胎并收集E14.5和E16.5胎鼠心脏，同时选取新生0.5 d(postnatal day 0.5, PND0.5)小鼠，以上述方法处死小鼠并收集心脏放入-80 ℃冰箱保存备用。

3 主要仪器及试剂

荧光定量PCR仪(Bio-Rad，CFX96);抗H3K9me3、Cx43、β-MHC和G9a-HMT单克隆抗体(Abcam)；TRIzol 总RNA提取试剂盒(BioTeke，北京百泰克生物技术有限公司)；荧光定量PCR试剂盒及逆转录试剂盒(TaKaRa);SDS-PAGE试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司);组蛋白甲基化酶试剂盒(GENMED)。

4 实验方法

4.1气相色谱法检测乙醇浓度 取5个10 mL容量瓶分别准确量取10 mL不同浓度的乙醇标准溶液，再分别加入0.5 mL内标溶液，混匀。然后用该溶液绘制标准曲线。选择好色谱条件进样，用试样组分峰面积与内标峰面积的比值查标准曲线得出的值，乘以稀释倍数即为样品中乙醇含量。

4.2比色法检测HMT活性 应用核蛋白提取试剂盒提取小鼠心肌组织核蛋白，BCA法测定蛋白浓度，运用组蛋白甲基转移酶测定试剂盒检测HMT活性，严格按照试剂盒说明操作。

4.3Western blot实验 提取小鼠心肌组织核蛋白，8%或12% SDS-PAGE凝胶分离核蛋白，PVDF膜半干转膜后，5%脱脂牛奶封闭2 h后分别加入兔来源抗H3K9me3、Cx43和β-MHC单克隆抗体及H3和β-actin兔来源多克隆抗体(均以1∶1 000稀释；中杉金桥生物技术有限公司)，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，每次15 min，然后加入HRP标记山羊抗兔的Ⅱ抗(中杉金桥生物技术有限公司；1∶5 000)脱色摇床上孵育2 h，TBST洗涤3次，每次15 min，运用Bio-Rad图像分析仪进行图像扫描；采用Quantity One 4.4软件进行分析。

4.4RT-qPCR 针对Gata4、Cx43和β-MHC基因CDS核心编码区设计特异性引物，引物用Primer Premier 5.0 软件设计，由大连宝生物公司合成。分别将Gata4、Cx43和β-MHC基因产物进行梯度稀释，运用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪扩增，做出标准曲线，得到R2值和扩增效率。Gata4的上游引物序列为5’-TGCCAACTGCCAGACTACCAC-3’，下游引物序列为5’-TCAGGTTCTTGGGCTTCCGT-3’；Cx43的上游引物序列为5’-TCCTTGGTGTCTCTCGCTCT-3’，下游引物序列为5’-CGCTGGCTTGCTTGTTGTA-3’；β-MHC的上游引物序列为5’-TGAGACGGATGCCATACAGA-3’,下游引物序列为5’-GCAGCCTGTGCTTGGTCTT-3’。反应条件：预变性95 ℃ 30 s;变性95 ℃ 5 s，退火延伸55 ℃ 30 s，39个循环。选取β-actin作为内参照。β-actin上游引物序列为：5’-CCTTTATCGGTATGGAGTCTGCG-3’，下游引物序列为5’-CCTGACATGACGTTGTTGGCA-3’。反应条件：预变性95 ℃ 30 s;变性95 ℃ 5 s，退火延伸59 ℃ 30 s，39个循环。所得数据用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪自带基于faffl原理的相对定量数据分析软件分析。

5 统计学处理

所有数据均用均数±标准差(mean±SD)表示。应用SPSS 18.0软件进行统计学分析。两组间比较采用t检验，多组间比较进行单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 56%乙醇灌胃后不同时点孕鼠体内乙醇含量

采用气相色谱法检测孕鼠静脉血中不同时点的乙醇含量，结果显示，随着灌胃后时间的增加，孕鼠体内乙醇含量逐渐增加，在灌胃后60 min血液乙醇含量达到高峰(1.25 g/L，该浓度已经达到人类醉酒状态)，而在灌胃后120 min血液乙醇含量接近于零，见图1。

Figure 1.Alcohol concentration in the blood at the different time points in the mice during pregnancy. Mean±SD.n=6.

图1孕鼠血液中不同时点的乙醇含量

2 孕期酒精暴露对小鼠心肌组织中HMT活性的影响

应用比色法检测酒精暴露小鼠心肌组织中HMT活性，结果显示,在E14.5、E16.5及PND0.5酒精暴露组小鼠心肌组织中HMT活性较生理盐水对照组均显著降低(P<0.05)，见图2。

Figure 2.The activity of histone methyltransferase (HMT) in the heart of mice. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsnormal saline group.

图2小鼠心肌组织中组蛋白甲基转移酶活性

3 孕期酒精暴露对心肌中G9a-HMT及组蛋白H3K9me3表达的影响

Western blot结果显示,在E14.5、E16.5及PND0.5小鼠心肌组织中，酒精暴露组G9a-HMT的表达水平与生理盐水对照组相比显著降低(P<0.05)。酒精暴露组蛋白H3K9me3甲基化水平显著低于生理盐水对照组(P<0.05)，见图3。

4 孕期酒精暴露对小鼠心脏发育相关基因表达的影响

RT-qPCR结果显示，酒精暴露组心脏核心转录因子Gata4的转录活性及下游基因Cx43和β-MHC的转录和翻译水平均显著高于生理盐水对照组(P<0.05)，见图4。

5 G9a-HMT抑制剂对酒精暴露小鼠心肌组织中G9a和心脏发育基因的影响

组蛋白H3K9me3甲基化水平在酒精暴露组显著降低，但在抑制剂干预组较酒精组降低更为显著(P<0.05)；且心脏发育相关转录因子Gata4及心脏发育下游基因Cx43和β-MHC在酒精暴露组显著升高，与生理盐水对照组相比差异显著(P<0.05)，而抑制剂干预组较酒精组升高更为显著(P<0.05)，见图5。

讨 论

先天性心脏病是儿童出生缺陷中常见的先天畸形之一。目前先天性心脏病治疗手段较为匮乏，尤其是复杂型先天性心脏病预后极差。酒精滥用是当前社会中较普遍的现象，孕期饮酒并不少见。研究证实[14-15]，酒精暴露可以导致严重心脏发育畸形，但具体机制仍不十分清楚。通过大样本先天性心脏病患儿基因筛查证实有一部分患儿并没有发现心脏发育相关基因的突变，因此我们推测这可能是由于基因的修饰状态发生了改变。表观遗传学是介导遗传和环境之间的桥梁，表观遗传学研究的内容主要包括组蛋白甲基化、乙酰化、磷酸化，DNA甲基化及microRNA修饰等。组蛋白H3K9me3的甲基化修饰参与了心脏发育、心肌肥厚及心衰等病理生理过程[8,16]。本课题组及其它研究团队证实酒精介导的组蛋白乙酰化修饰失衡参与了孕期酒精暴露致子代心脏发育相关基因的异常表达，但给予组蛋白乙酰化酶抑制剂只能部分逆转酒精所致的基因表达异常[17-18]。因此，我们推测其他的表观遗传调控机制也可能参与了该病理生理过程。动物在某些疾病上的表现与人类非常相似，且临床试验前的动物实验是研发新药的必经过程，故本研究应用酒精灌胃孕鼠来探讨组蛋白甲基化修饰在酒精暴露致心脏发育相关基因表达异常中的作用及其机制，希望能为进一步明确人类孕期饮酒致子代心脏发育畸形提供参考资料。

Figure 3.The expression of H3K9me3 and G9a-HMT in the heart of mice. N: normal group; Al: alcohol group; NS: normal saline group. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNS.

图3小鼠心肌组织中组蛋白H3K9me3和组蛋白甲基转移酶亚型G9a的表达水平

Figure 4.The expression of cardiomyogenesis genesGata4,Cx43 andβ-MHCat mRNA and protein levels in mice. A: the mRNA expression of Gata4; B: the mRNA expression of Cx43 and β-MHC; C and D: the protein expression of Cx43 and β-MHC, respectively. N: normal group; Al: alcohol group; NS: normal saline group. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNS.

图4小鼠心脏发育相关基因Gata4、Cx43和β-MHC的mRNA及蛋白表达水平

Figure 5.The effects of G9a-HMT inhibitor BRD4770 on the expression of H3K9me3, Cx43 and β-MHC in myocardial tissues of mice treated with alcohol. A: the protein level of H3K9me3; B: the mRNA expression of Cx43 and β-MHC; C and D: the protein expression of Cx43 and β-MHC, respectively. N: normal group; Al: alcohol group; AB: alcohol+BRD4770 group; NS: normal saline group. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsNS;#P<0.05vsAl.

图5G9a-HMT抑制剂BRD4770对酒精暴露小鼠心肌组织中H3K9me3、Cx43和β-MHC表达的影响

心脏发育异常的基础首先是心脏发育相关转录因子及其下游基因表达异常，而心脏核心转录因子Gata4与孕期酒精暴露致心脏发育异常关系密切[13]。本研究结果表明，孕期酒精暴露可致组蛋白H3K9me3甲基化水平显著降低，而心脏发育核心转录因子Gata4及心脏发育下游基因Cx43和β-MHC在mRNA及蛋白水平过表达，提示组蛋白甲基化修饰可能参与了酒精暴露所致心脏发育基因表达异常。组蛋白甲基化修饰受到组蛋白甲基转移酶和组蛋白去甲基化酶双重调控；大多数情况下组蛋白甲基转移酶主要是导致组蛋白的甲基化,沉默基因的表达，而组蛋白去甲基化酶则是导致组蛋白去甲基化,开启基因的表达。因此，我们应用比色法检测了组蛋白甲基转移酶活性，结果显示酒精暴露组该酶活性与对照组相比显著降低，提示组蛋白甲基转移酶在该过程中可能发挥了调控作用。但目前研究证实组蛋白甲基转移酶包括多种亚型[19]。于是我们检测了在心肌组织中表达且与心脏发育关系较为密切的一种亚型G9a，结果正如所预料的，该亚型的表达水平在酒精组也显著低于对照组。因此，推测该酶是上述病理生理过程中的一个关键调控因子。为了进一步证实该推测，孕期酒精暴露小鼠被给予G9a-HMT特异性抑制剂处理，结果表明心肌组织中组蛋白H3K9me3甲基化水平较酒精暴露组进一步降低，且心脏发育核心转录因子Gata4及心脏发育下游基因Cx43和β-MHC表达水平在抑制剂处理组显著高于酒精组。以上结果均进一步证实了G9a-HMT在酒精暴露致心脏发育相关基因表达中的重要调控作用。但是，其他HMT亚型和组蛋白去甲基转移酶是否参与该病理生理过程以及上游信号通路是什么仍不清楚，且其他亚型的组蛋白(如H4)及其他甲基化位点本研究仍未检测，它们是否参与上述过程仍有待进一步研究证实。